论文总字数：24280字

摘 要

代谢组学是以高通量、高灵敏度、高分辨率的现代仪器分析方法为手段，对细胞、体液、组织中所有代谢物进行无偏向的定性与定量分析的一门学科。气相色谱- 质谱联用技术具有较高的检测灵敏度和鉴定准确度，通过标准谱图库的比对可对代谢物进行快速的鉴定，因此被广泛应用于生物样品的代谢产物的检测中。纳豆芽孢杆菌菌是微生物发酵法生产维生素K2的重要菌株。本论文以纳豆芽孢杆菌为研究对象，优化代谢物的提取方法，利用代谢组学技术了解胞内代谢产物与发酵性能之间的相互关系，为发酵工艺的进一步优化提供更好的依据与视角。

本文首先对比不同溶剂对萃取代谢物种类的影响，最终选择了用稳定性好且萃取程度高的50%甲醇溶液做萃取剂，建立了 GC-MS分析胞内代谢物的方法；其次考察了不同转速对纳豆芽孢杆菌产维生素K2的影响，包括对甘油消耗、细胞生长以及维生素K2的产量，得出高转速有利于菌体的生长和维生素K2的合成。最后利用建立的代谢组学方法分析不同发酵时间和不同转速条件的代谢物差异，得出：磷酸，缬氨酸等物质对菌体代谢影响较大，因此分析后续的实验可以适量添加磷酸盐，氨基酸类物质来促进细胞代谢。

关键词: 代谢组学 微生物 气相色谱- 质谱联用 纳豆芽孢杆菌

Study on the metabolic genomics of vitamin K2 production bacteria Bacillus subtilis

Abstract

Metabonomics involves the unbiased quantitative and qualitative analysis of the complete set of metabolites present in cells, body fluids and tissues (the metabolome) based on modern analytic technique with high throughput, high sensitivity, and high resolution. Gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) is used to gain qualitative results of detected metabolites for biological samples as it provides superior distinguishability, detection sensitivity and integrated standard mass spectrometry library. Natto bacillus strain is one of the important strains which can produce vitamin K2 by fermentation. In this study, the constituents of quenching solution and the derivatization conditions of Natto bacillus strain were optimized, and the relationship between microcosmic metabolites and apparent characteristics were nvestigated by comparative metabonomics technology to provide better guidance for the improvement of vitamin K2 fermentation technology.

In this study, we compared the effect of different solvent to extract metabolin firstly. The final choice was 50% methanol solution as an extractant for its good stability and high degree. Then establish the method of GC-MS analysis of intracellular metabolites; secondly, we studied the influence of different speeds of the Bacillus subtilis natto production of vitamin K2, including of glycerol consumption, cell growth and vitamin K2 yield .Than come to that high speed is conducive to the synthesis of cell growth and vitamin K2. Finally, analysed the differences of different fermentation time and different speed conditions by the methods of the metabolic group. It is concluded that: phosphoric acid, valine and other substances have a greater impact on cell metabolism. Therefore, the analysis of subsequent experiments could add the amount of phosphate, amino acids to promote cell metabolism.

Keywords: Metabonomics , Microorganism , Gas chromatography-mass spectrometry , Bacillus natto

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 文献综述 2

1.1 维生素K2概述

1.1.1维生素K2简介

1.1.2 维生素K2的生理功能

1.1.3 维生素K2的生物合成

1.2 微生物代谢组学

1.2.1 代谢组学简介

1.2.2 微生物的代谢物

1.2.3 GC-MS联用技术介绍

1.2.4 GC-MS分析代谢物的研究方法

1.2.5GC-MS联用技术在代谢组学中的应用

1.3研究目的与意义

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料

2.1.1菌种

2.1.2实验试剂

2.1.3实验仪器

2.1.4培养基 

2.2 实验方法

2.2.1培养方法

2.2.2 代谢物提取方法

2.3 分析方法 2.3.1 甘油测定

 2.3.2 OD值的测定

2.3.3 VK2的检测方法

2.3.4 GC/MS检测条件

2.3.5代谢物的相对含量计算

第三章 结果与讨论 13

3.1不同提取方法对胞内代谢物分析的影响

3.2不同转速对细胞代谢产物的影响

3.2.1不同转速条件对纳豆芽孢杆菌生长的影响

3.2.2不同转速条件对甘油消耗的影响

3.2.3不同转速条件对VK2产量的影响

3.2.4不同转速条件下对胞内代谢产物的影响

第四章 结论与展望 23

4.1 结论

4.2 展望

致 谢： 28

第一章 文献综述

1.1 维生素K2概述

1.1.1维生素K2简介

SatsT等人^[1] 1996年从发酵的纳豆中提取了纯化到的维生素K2(VK2)，它为甲萘醌类系列的化合物，是一种脂溶性凝的血类维生素。能够显著的治疗和预防骨质疏松症，被称为了“第四代抗骨质疏松的产品”。根据其分子结构上的 C-3位异戊二烯侧链的长短的不同共有14 种形式，以MK-n表示（n是指侧链上的异戊二烯单位的个数），最为常见的是甲萘醌-4（MK-4）和甲萘醌-7（MK-7）。MK-4的分子量与维生素K1相似，血清半衰期都很短的，要实现血液的循环需要比MK-7推荐剂量要高出1000倍。而肠道可快速的吸收MK-7，依靠大的脂质颗粒进行运输，血液的半衰期长，而它能停留在循环系统中很长的时间，因此除在肝脏外的骨骼和动脉中也能发挥重要作用。

图1 维生素K2分子结构式

Figure 1 Molecular structure of vitamin K2

1.1.2 维生素K2的生理功能

维生素K2有多种重要的生理功能：

(1)治疗及预防骨质疏松症

(2)维生素K2可用来预防肝硬化防止发展成肝癌

(3)可以治疗维生素K2缺乏性的出血

(4)有利尿、强化肝脏的解毒功能，还能降低血压。

1.1.3 维生素K2的生物合成

VK2的生物合成途径及反馈抑制的机制在用纳豆菌株接种蒸煮的大豆所生产的纳豆中，产生了较高量的VK2(MK-7)。通过深入的研究得出，异戊二烯侧链的合成途径与萘醌骨架合成的途径组合成了VK2的生物合成的途径。因为在萘醌骨架上连接着的异戊烯链上的异戊二烯的数量的不同而使MK分成MK1-14 2种，维生素K2就是其中的MK-7，其生物合成的途径如图2所示。

异戊二烯侧链 萘醌的骨架

↓ ↓

乙酰辅酶A 4-磷酸赤藓糖

↓ ↓

甲羟戊酸（盐） 脱氧-D-职拉伯庚酮糖-7磷酸盐(DAHP) L-酪氨酸

↓ ↓ ↑

焦磷酸异戊烯 本草酸盐 Arogenate L-苯丙氨酸

↓ ↓ ↑ ↑

焦磷酸牦牛儿（盐） 多支盐酸 苯酸盐 苯丙酮酸盐

↓ ↓ (prephenate)

焦磷酸多聚异戊烯 异分支酸盐 邻氨基苯甲酸 L-色氨酸

↓

O-琥珀酰苯甲酸盐

↓

1，4-2羟基-2-萘甲酸盐（DHNA）

↓

萘醌-n(n=14)

图2萘醌(VK2)的生物合成的途径及芳香族氨基酸的反馈抑制^[2]

Figure 2 The biosynthetic pathway of the naphthalene VK2 and the inhibition of the aromatic amino acids

1.2 微生物代谢组学

1.2.1 代谢组学简介

代谢组学是近年来迅速发展起来的一门新兴学科，它以高通量、高灵敏度、高分辨率的现代仪器分析方法为手段，结合模式识别等统计学分析方法，考察生物体系（细胞、组织或生物体）受到干扰后，代谢组的变化或其随时间的变化规律。所谓代谢组是基因组的下游产物或最终产物，是参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子代谢物的集合，主要包括相对分子质量在1000以内的内源性代谢物。

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