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摘 要

在本文中，建立和验证了使用GC-MS对大鼠附睾液内源性小分子代谢物指纹图谱进行检测的方法学。附睾液样品采用甲醇蛋白沉淀后，将所得上清真空挥干，甲基肟化，三甲基硅烷化后进行GC-MS分析。GC-MS谱图中分离和鉴定出110个内源性代谢物，选择其中23个化合物进行定量分析，以评估本方法的线性度、精密度和灵敏度。结果表明：在0.063到1.000（v/v，附睾液/附睾液 水）的浓度范围内，23个内源性代谢物的质谱响应与相对浓度之间的线性度、精密度和灵敏度均符合生物样品的分析要求，通过冻融稳定性测试表现出较好的重现性。

将所建立的GC-MS的代谢组学研究方法成功应用于少精子症大鼠模型中附睾液样品的分析。偏最小二乘法（PLS）分析显示出模型组大鼠和正常组大鼠的附睾液内源性小分子代谢物存在显著的组间差异以及代谢物随着造模时间的变化而改变。因此，所建立的基于GC-MS的代谢组学分析方法能够适用于附睾液样品的检测。

关键词：GC-MS 附睾液 代谢组学 少精子症

GC-MS analysis of rat epididymal fluid for metabonomic research

Abstract

For the qualitative and quantitative detection of low-molecular endogenous metabolites in rat epididymal fluid, an optimized protocol using GC-MS was established and validated. The epididymal fluid samples were first extracted by methanol, then centrifugated, the supernatant was dried, methoximated, and trimethylsilylated to be analyzed by GC-MS. In GC-MS chromatogram, 110 low-molecular endogenous compounds were separated and identified, of which 23 metabolites were further studied for quantitative analysis to evaluate the linearity, precision, and sensitivity of the established method. Over the range of 23 metabolites from 0.063 to 1.000 (v/v, epididymal fluid / epididymal fluid water), the linearity, precision and sensitivity between mass spectrometry responses and relative concentrations all met the requirements for biological specimen analysis.

The methodology of GC-MS-based metabonomics was successfully applied to epididymal fluid samples from oligospermia model rats. Separated clustering of oligospermia rats and normal rats were obviously distinguished by partial least square (PLS) analysis. The time-dependent metabolites alterations were also detected. According to this study, the methodology of GC-MS-based metabonomics was reliable for anslysis of epididymal fluid samples.

KEYWORDS: GC-MS; Epididymal fluid; Metabonomics; Oligospermia

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1男性不育与少精子症 1

1.2附睾与附睾液 1

1.2.1附睾的结构 1

1.2.2附睾的功能 2

1.2.3精子在附睾中的成熟 3

1.3代谢组学 3

1.3.1代谢组学研究的任务 3

1.3.2代谢组学研究的步骤 3

1.4气质联用（GC-MS） 4

1.4.1 GC-MS概述 4

1.4.2 GC-MS 分析代谢物的研究方法 4

第二章 材料与方法 6

2.1材料与仪器 6

2.1.1实验动物 6

2.1.2主要试剂 6

2.1.3主要仪器 6

2.2标准溶液配制 7

2.3动物手术及样品制备 7

2.3.1大鼠少精子症模型的制作 7

2.3.2附睾液样品制备 8

2.3.3附睾液样品预处理 8

2.4 GC-MS分析条件 8

2.5方法学验证 9

2.5.1线性度 9

2.5.2精密度 9

2.5.3灵敏度 9

2.5.4稳定性 9

2.6代谢组学统计分析 10

第三章 结果与讨论 11

3.1大鼠少精子症模型 11

3.1.1一般状态观察 11

3.1.2性腺指数 11

3.1.3精子数量和活动率 11

3.2附睾液样品预处理 12

3.3基于GC-MS的附睾液代谢组学分析 12

3.4方法学验证 13

3.4.1线性度 13

3.4.2精密度 14

3.4.3灵敏度 15

3.4.4稳定性 15

3.5代谢组学多维统计分析 16

3.5.1偏最小二乘法分析 (PLS) 16

3.5.2聚类分析 18

3.5.3 T-检验 19

第四章 结论与展望 20

4.1结论 20

4.2展望 20

参考文献 21

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1男性不育与少精子症

据世界卫生组织调查指出，当今世界约20%的家庭受到不孕不育问题的困扰，其中男女双方因素各占一半。随着生活环境的恶化，激烈的竞争导致的工作压力日益增长，男性不育的发病率出现了明显增加的趋势，大大影响家庭和谐与社会稳定。

在导致男性不育的众多病因中，少、弱精子症占首位。其中，少精子症是指男性三次检查的平均精子密度低于2.0×10⁶/ml ^[1]。少精子症病因复杂，一方面可能是由于睾丸生精功能低下，影响因素包括年龄增长、化学品接触、辐射、染色体异常、内分泌紊乱、生殖道感染等；另一方面，精道（附睾、输精管等）的血循环受阻如精索静脉曲张^[2]，精道梗阻^[3]或逆行性射精^[4]也可导致少精子症。总的来说，睾丸与附睾功能异常导致的精子发生与成熟障碍是少精子症的内在影响因素。因此，研究睾丸与附睾生理功能，寻找生物标志物并研究其作用机理，对探究少精子症发病机制，进而指导临床用药，具有重要意义。

1.2附睾与附睾液

精子生成主要包括睾丸精子产生和附睾精子成熟两个环节，而精子成熟是实现男性生殖功能的关键^[5,6]。精子在睾丸中产生后并不具备运动能力和受精能力，因此不具生育能力。只有从睾丸输出小管进入附睾后，精子在运送、储存过程中与附睾液作用，结构、代谢与功能均发生改变，才能获能并最终成熟，起到生殖功能。精子在附睾中储存，在附睾中运送，也在附睾中获能、成熟。作为男性生殖系统重要组成部分的附睾如果功能受损，必将阻碍精子获能成熟，致使精子活力下降，进而导致少、弱精子症。

1.2.1附睾的结构

位于睾丸后上方的附睾是一个长条状，紧密盘绕折叠形成的管状器官，上端通过输出小管连接到睾丸，下端通过输精管连接到尿道。形态学将附睾分为起始部、头部、体部和尾部四部分^[7]。人类附睾的特殊之处在于与其他物种相比，其明显的尾部缺失，因此人类附睾的精子储存能力显著低于其他物种。

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