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摘 要

全局调控蛋白 IrrE 是一个特殊的能够修复调节 DNA 损伤的因子，可在细胞受损时提高各修复基因的表达。共有 7 种来源不同的 IrrE 蛋白在已经完成测序的异常球菌中被发现了，通过序列比对和同源建模发现其氨基酸序列相似度很高且保守结构域也相同，这可能预测了其功能上的相似性。此外，IrrE 在大肠杆菌及油菜中的表达很大程度上增强了其宿主的耐盐性，体现出极高的应用价值。大肠杆菌的生长对数期在正常生长条件下能被 IrrE 蛋白延长，细胞生物量也能明显提高，这表明 IrrE 对增强大肠杆菌的一般胁迫抗性具有重要作用。经过不同盐浓度冲击，IrrE 能使大肠杆菌的存活力变强，这就说明 IrrE 在大肠杆菌中的异源表达对其胁迫抗性也有一定的作用。到目前为止所发现的都来源于异常球菌属的 4 个 IrrE 蛋白的一级结构都相对保守，N-端结构域的氨基酸序列有很大差别，但都含有一个相同的结构。

本研究过程中成功构建了重组菌 E.coli.Suc260/pMD19-T-GroE-irrE,通过预实验获知出发菌株 suc260 在 0.8 M 到 1.0 M 浓度的 NaCl 之间对生长有很大的影响，故本实验选择 0.8 M 浓度作为研究对象。通过实验发现重组菌能够很好的在 0.8 M 浓度的钠盐条件下生长，而出发菌却受到很高的抑制。利用一步厌氧发酵结果显示，出发菌不仅在生长和产酸上，相对与出发菌都有一定的提升。

关键词：全局性调控因子- IrrE ;大肠杆菌;耐受力

ABSTRACT

Global regulatory protein IrrE is a special factor which can repair the damaged DNA.It can increase the expression of repair genes when cells are damaged.Seven different IrrE proteins have been found in the sequenced abnormal bacteria. By sequence alignment and homology modeling,we found that the amino acid sequence similarity is high and their conserved domains are also the same.It is possible to predict the similarity of their functions.In addition, the expression of IrrE in E. coli and the rape largely enhanced the salt tolerance of its host.It demonstrated the high value.Under the normal growth conditions, IrrE protein could extend the growth of E. Coli and the cell biomass can be significantly improved.This indicates that IrrE plays an important role in enhancing the general stress resistance of E.coli.After the impact of different salt concentrations, IrrE can raise the viability of E. coli.This explains that it’s heterologous expression in E. coli also has a certain role in stress resistance.Now the primary structures of the four IrrE proteins from abnormal Cohn are relatively conserved.N- terminal domain of the amino acid sequences are different,but all contain an identical structure.

The course of the study successfully constructed the bacteria E.coli.Suc260 / pMD19-T-GroE-irrE.We were informed that the starting strain suc260 has a great influence on growth between 0.8M to 1.0M concentration of NaCl.So this concentration chosed 0.8M for the study.It was found that recombinant bacteria can grow well under conditions of 0.8M sodium concentration.But the original strain was greatly inhibited.The results of anaerobic fermentation showed that the original strain has some improvement not only in the growth but also in acid productions.

Keywords：Global regulatory protein-IrrE;E.coli;Tolerance

目 录

摘 要

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 立题背景 1

1.2 全局调控蛋白 IrrE 1

1.2.1 IrrE 蛋白的发现 1

1.2.2 IrrE 蛋白的结构域分析 2

1.2.3 IrrE 功能的鉴定 2

1.2.4 全局调控蛋白 IrrE 的调控模型 2

1.3 耐辐射异常球菌的极端抗性 4

1.3.1 电离辐射抗性 4

1.3.2 过氧化氢抗性 4

1.3.3 紫外线辐射抗性 4

1.3.4 丝裂霉素 C 抗性 5

1.3.5 干旱抗性 5

1.4 耐辐射异常球菌 IrrE 的作用机制 5

1.4.1 IrrE 蛋白激活电离辐射后 recA 及 pprA 基因的表达 5

1.4.2 IrrE 蛋白提高过氧化氢酶活性 5

1.5 IrrE 的异源表达提高宿主的胁迫抗性 5

1.6 耐辐射异常球菌中辐射应答机制的假设模型 7

1.7 立题意义 8

1.8 国内外研究现状 8

1.9 本课题的研究目标与研究内容 9

1.9.1 研究目标 9

1.9.2 研究内容 9

第二章 材料和方法 10

2.1 实验材料 10

2.1.1 菌株和质粒 10

2.1.2 培养基 10

2.1.3 主要仪器 11

2.1.4主要试剂及配置 11

2.2 实验方法 12

2.2.1 PCR 扩增 12

2.2.2 转化 12

2.2.3 酶切 13

2.2.4 胶回收 13

2.2.5 质粒提取 13

2.3 分析方法 14

2.3.1 高盐浓度的确立 14

2.3.2 有氧生长曲线绘制 14

2.3.3 一步厌氧发酵 14

第三章 实验结果与讨论 16

3.1 组成性质粒 pMD 19-T-GroE-irrE的构建 16

3.1.1 利用 over-lap PCR 方法构建重组质粒示意图 16

3.1.2 重组质粒 pMD 19-T-GroE-irrE 构建结果图 16

3.1.3 利用酶切鉴定重组质粒 17

3.2 E.coli. Suc 260 耐盐梯度实验 17

3.3 E.coli. Suc 260 和重组菌在 0.8 M 条件下的生长曲线 17

3.4 E.coli. Suc 260 和重组菌在 0.5 M 钠盐条件下的发酵结果 18

第四章 结论 19

4.1 结论 19

4.2 不足之处与未来展望 19

4.2.1 不足之处 19

4.2.2 未来展望 19

参考文献 20

致 谢 22

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