论文总字数：16170字

摘 要

随着分离纯化技术以及各种分析技术的飞速发展，多肽类药物研究正逐渐成为当代药物研究的一大热点。利那洛肽是一种鸟苷酸环化酶C（GC-C）激动剂，可用于治疗慢性特发性便秘（CIC）和便秘肠易激综合征（IBS-C），而线性利那洛肽是利那洛肽未成环的前体。本实验采用RP-HPLC法，分别考察了流动相、pH值、洗脱梯度、柱温等对线性利那洛肽及其杂质分离的影响，不断优化色谱条件，从而建立一个用于分离线性利那洛肽与其相关杂质的方法。方法：色谱柱：SinoChrom ODS-BP(5μ m, 2 5 0 m m × 4 . 6 m m)；流动相A：30 mmol · L^-1磷酸盐缓冲液(pH2)；流动相B：乙腈；流速：1m l · m in^-1；检测波长：UV=220nm；进样量：20μL；柱温：40℃；洗脱梯度：B%：10%→20%(0-10min)，20%等度(10-22min)，20%→50%(22-35min)。

实验结果表明，样品溶剂的配比不同会对主峰峰形造成一定影响，本实验选用的样品溶剂为水：乙腈（均含0.1%甲酸）=2:1。在0.25-4.00mg/ml范围内线性利那洛肽峰面积与浓度呈现良好的线性关系。通过考察系统精密度得出主峰的峰面积和保留时间的RSD%值分别为0.44%和1.01%，可见本实验分析系统有较高的精密度，能满足实验要求。实验还分别考察了0-24h内以及15天内不同保存温度下，样品溶液的稳定性。结果表明，在0-24h内，主峰峰面积的RSD%值为0.95%，样品溶液稳定性良好。在15天内，保存在-20℃的样品溶液稳定性良好。本实验方法简单易行，结果稳定可靠，可用于线性利那洛肽与其相关杂质的分离分析。

关键词： 多肽纯化 HPLC 梯度洗脱

The establishment of HPLC separation and analysis method of linear linaclotide

Abstract

With the rapid development of separation and purification technology and various analysis techniques,study on polypeptide drug has gradually became an active area of contemporary medicine analysis research. Linaclotide is a guanylate cyclase C (GC-C) agonist,which can be used for the treatment of chronic idiopathic constipation (CIC) and constipation irritable bowel syndrome (IBS-C), and the linear linaclotide is a precursor of linaclotide. This experiment has used the RP-HPLC to study the effects of the mobile phase, pH value, gradient elution, column temperature on the separation of linear linaclotide.The experiment is committed to optimize chromatographic conditions, so as to establish an analytical method that is widely applicated.Method: Column: SinoChrom ODS-BP(5μ m, 2 5 0 m m × 4 . 6 m m); Mobile phase A:30 mmol·L^-1phosphate(pH2); Mobile phase B:acetonitrile;Flow rate:1mL·min^-1 ; The detection wavelength:220nm; Gradient elution: B%:10%→20%(0-10min),20%(10-22min),20%→50%(22-35min); Sample quantity:20μL; Temperature: 40℃.

The experimental result shows that the different solvents will cause impacts on the peak,the solvent used in this experiment was water:acetonitrile(both containing 0.1% formic acid)=2:1. There was a good linear relationship between the area of linaclotide peak and the concentration range in 0.25-4.00mg/ml.The precision of the system is investigated by the method used in the experiment. The result shows that the RSD% of peak area is 0.44%, the RSD% of retention time is 1.01%,so that the analysis system has high precision,which can meet the requirements.The stability of the sample solution is investigated by the method used in the experiment in 24 hours,and in different temperature in 15 days.The result shows that the RSD% of peak area is 0.95% in 24 hours,and the stability of sample solution is good.the sample stored in the -20℃ is more stable than in the 0℃ and the room temperature in 15 days.The experimental method is stable and reliable,which can be used for the separation and analysis.

Keywords: peptide purification;HPLC;gradient elution

目 录

摘 要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 线性利那洛肽的性质和应用 1

1.2 多肽的一般分离方法 2

1.2.1 离子交换色谱（IEXC） 2

1.2.2 凝胶过滤色谱（GFC） 2

1.2.3 高效液相色谱（HPLC） 2

1.3 国内外研究进展 3

1.3.1 国内研究进展 3

1.3.2 国外研究进展 3

1.4 本实验的研究目的与内容 4

第二章 实验方法 5

2.1 试剂与仪器 5

2.1.1 试剂 5

2.1.2 仪器 5

2.2 溶液的配制及色谱条件 6

2.2.1 样品溶液的配制 6

2.2.2 流动相的配制 6

2.2.3 色谱条件 6

第三章 结果与讨论 7

3.1 色谱条件的选择与优化 7

3.1.1 溶样方法的选择 7

3.1.2 检测波长的选择 8

3.1.3 流动相的优化 8

3.1.4 柱温的选择 11

3.2 标准曲线的绘制 12

3.3 方法学考察 13

3.3.1 精密度试验 13

3.3.2 稳定性试验 14

第四章 结论 16

4.1 结论 16

参考文献 17

致 谢 19

第一章 文献综述

近年来，有研究发现在人体生命活动中起关键作用的不全是蛋白质大分子，还包括一些结构相对简单的小分子多肽物质^[1]。目前我国对多肽类药物的研究日新月异，人们通过建立多肽的分离方法，形成完整的多肽分离体系，不断优化分离条件，以满足科研和生产的需要^[2]。

1.1利那洛肽的性质和应用

利那洛肽是一种鸟苷酸 环化酶C（GC-C） 激动剂，能治疗慢性 特发性便秘和便秘肠易 激综合征，利那洛肽及其代谢产物均可与肠道GC-C结合，导致细胞内以及细胞外环鸟苷酸 （cGMP）的浓度均升高。细胞内cGMP浓度的升高能促进肠液分泌，加强胃肠道的蠕动，导致排便频率增加。细胞外cGMP浓度的升高可降低痛觉神经的灵敏度，使人的痛感不那么强烈，从而改善腹痛等症状。而一般的治疗便秘的药物，并不能减轻患者的腹胀、腹痛 等一些不良反应。能减轻患者腹部痛感的三环类抗抑郁药却不能治疗便秘，甚至会加重便秘症状。所以，随着对IBS-C患病机制的深入研究，利那洛肽作为一种新型药物深受科研人员与制药公司的青睐。例如，阿斯利康于2012年10月的公告宣称，将与铁木制药在中国开发、销售利那洛肽产品^[2~4]。图1所示为利那洛肽的结构简图。

请支付后下载全文，论文总字数：16170字