论文总字数：18074字

摘 要

本论文首先将构建敲除脂肪酸调控因子（△fasR），然后将其与敲除质粒pK18mobsacB相连接构建重组质粒pK18mobsacB-△fasR。接着将重组质粒pK18mobsacB-△fasR电转化进入E.coli JM109，进行培养筛选，挑取转化子进行PCR验证和双酶切验证。再将表达重组质粒pK18mobsacB-△fasR电转进入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，得到一次重组菌，提基因组，然后进行电泳。最后挑取正确的一次重组菌进行二次重组，通过定性分析和定量测定证实经过基因工程构建好的菌株具有合成脂肪酸的能力。

关键词：谷氨酸棒状杆菌 脂肪酸 fasR 敲除与重组

Deletioning fasR gene of Corynebacterium Glutamicum and its effects on fatty acid production

Abstract

Firstly, fatty acid regulatory factor that knockout partial basic group will be build, connecting it with pK18mobsacB, and we will obtain the recombinant plasmid-- pK18mobsac-△fasR.. Secondly, pK18mobsacB-△fasR was put into E.coil JM109 competent cell by chemical transformation. After the cultiration and filtration,choosing the transformant into the double enzyme authentication system. Next, pK18mobsacB-△fasR was put into the competent cell of corynebacterium glutamicum by electroporation and getting the first recombinant bacteria. Finally, choosing the right first recombinant bacteria for quadratic restructuring. A genetic engineering was gain by the qualitative analysis and quantitative, and the strains can synthesis fatty acid.

Key words: Corynebacterium glutamicum；Fatty acid；FasR；Knockout and restructuring

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1 脂肪酸的生产研究概况 1

1.1.1脂肪酸的理化性质 1

1.1.2 脂肪酸的化学合成法 1

1.1.3脂肪酸的生物转化合成法 2

1.2 脂肪酸的应用及市场前景 3

1.2.1脂肪酸的工业应用 3

1.2.2脂肪酸的市场现状及前景 4

1.3 本实验研究的意义和主要内容 4

1.3.1 本实验研究的意义 4

1.3.2 本实验研究的主要内容 4

第二章 材料与方法 6

2.1实验材料 6

2.1.1菌种和质粒 6

2.1.2实验试剂 6

2.1.3实验仪器 7

2.2实验方法 8

2.2.1实验所用的培养基 8

2.2.2分子生物学常规操作 8

2.2.3大肠杆菌电转感受态细胞制备及电转化条件 ……………………………… 11

2.2.4谷氨酸棒杆菌电转感受态细胞制备及电转化条件 11

2.2.5 通过重叠PCR获得ΔfasR及其验证 12

2.2.6重组质粒pK18mobsacB-ΔfasR的构建及验证 13

2.2.7二次重组获得 Corynebacterium glutamicum-△fasR 14

2.2.8摇瓶发酵与HPLC-ELSD检测……………………………………………………14

第三章 结果与讨论 15

3.1通过重叠PCR获得ΔfasR及其验证 15

3.2重组质粒pK18mobsacB-ΔfasR的构建及验证 16

3.3二次重组获得 Corynebacterium glutamicum-△fasR 17

3.4摇瓶发酵与HPLC-ELSD检测..........................................18

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

脂肪酸作为一种重要的平台化合物，可进一步合成高能比生物燃料，高附加值油脂化学品（ω-3多不饱和脂肪酸、聚羟基脂肪酸酯、脂肪醇等），因此在医药、食品、化工等诸多领域具有广泛的应用前景^[6,9,11]。但是，就目前来看，工业化脂肪酸主要由化学合成法制备，存在反应步骤繁琐，条件苛刻，目标产物选择性差等不利条件，不适于作为前体物质进一步合成下游产物等诸多缺点^[9]。因而，生物法合成脂肪酸逐渐成为当今基础性平台化合物的研究热点。目前，生物法合成脂肪酸的研究主要集中在大肠杆菌，但其生产能力仍然很低，且分离纯化出的脂肪酸可能含有热源性物质脂多糖，不利于医药食品的应用^[15]。谷氨酸棒状杆菌作为典型的革兰氏阳性菌，细胞壁不含脂多糖，有利于脂肪酸的分离纯化；其次，胞内不存在脂肪酸降解的β氧化途径，从而有利于脂肪酸的积累^[12,13]。

1.1 脂肪酸的生产研究概况

1.1.1脂肪酸的理化性质

脂肪酸（fatty acid），是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是一种有机物，直链饱和脂肪酸的通式是C_（n）H_{（2n 1）}COOH，低级的脂肪酸是呈现无色液体的状态，存在刺激性气味，高级的脂肪酸呈现蜡状固体的状态，无明显嗅到的气味。脂肪酸是一种最简单的脂，它是许多更为复杂的脂的构成成分^[14]。脂肪酸在有氧的条件下，可氧化分解为CO₂和H₂O，释放大量能量，因此脂肪酸是机体主要供能途径之一。

1.1.2脂肪酸的化学合成法

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