论文总字数：20756字

摘 要

琥珀酸生物合成被限制到在细胞内的供给NADH的谷氨酸棒状杆菌，在这里,我们采用染色体整合糖酵解酶进一步证明连续改善葡萄糖代谢缺氧。此外，证明NAD 从埃希氏大肠杆菌甘油脱氢酶对谷氨酸棒杆菌增长NADH。通过添加甘油脱氢酶（GDH）基因（gldA）重组表达来提高谷氨酸帮杆菌细胞内NADH / NAD 比值，使用厌氧发酵过程产生的重组菌株，90 g葡萄糖发酵48h琥珀酸的平均产率为0.8 g/ g，该方法可以产生一个更多的还原细胞内环境提高C4途径通量,目的以提高琥珀酸生产。

关键词:谷氨酸棒状杆菌 甘油脱氢酶NADH的生成 生产琥珀酸

Abstract

Succinate biosynthesis is limited to the supply of intracellular available NADH in C. glutamicum. Here, we employ chromosomal integration of glycolytic enzyme (gapA) to demonstrate further successive improvement glucose metabolism under oxygen deprivation. Furthermore, we show that an NAD -independent glycerol dehydrogenase from Escherichia coli holds promise for increasing available NADH in C. glutamicum. The recombinant C. glutamicum expressing gldA showed intracellular NADH/NAD ratio have been improved through adding glycerol. Using anaerobic fed-batch fermentation process, the recombinant strain produced 90 g succinate l^-1 with an average yield of 0.8 g succinate g^-1 glucose during 48h. The strategy can produce a more reductive intracellular environment to increase the C₄ pathway flux and enhance succinate production.

Keywords Corynebacterium glutamicum·Glycerol dehydrogenase·NADH generation·Succinic acid production

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1琥珀酸的理化性质及应用 1

1.1.1 琥珀酸的理化性质 1

1.1.2 琥珀酸的应用 1

1.2 琥珀酸的市场前景和前景分析 2

1.3 琥珀酸的生产方法概述 3

1.3.1 化学合成法 5

1.3.2 生物转化法合成琥珀酸 5

1.3..3 生物发酵生产琥珀酸

1.4 产琥珀酸基因工程研究 3

1.4.1 NADH代谢调控对微生物物质代谢的影响 6

1.4.2 NADH生理代谢功能 7

1.4.3 基于生化工程的NADH代谢调控 7

1.5 基于代谢工程的NADH代谢调控 6

1.5.1 过量表达NADH代谢相关酶调控NADH代谢 7

1.5.2 引入外源代谢途径调控NADH代谢 7

1.6 本论文研究的意义及主要内容 6

1.6.1 研究的意义 6

1.6.2 研究的主要内容 7

第二章 材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 细菌菌株，质粒 8

2.1.2 实验所用的培养基及培养条件

2.2 实验方法 10

2.2.1 遗传方法 10

2.2.2 酶的测定 10

2.2.3 培养条件对细胞生长和生产琥珀酸的影响 10

2.2.4 分析方法 11

第三章 结果与讨论 15

3.1 整合gapA在缺氧条件下提高琥珀酸的产量

3.2 菌株对甘油脱氢酶表达的影响

3.3 GLDA表达对细胞内NADH/NAD 比值的影响

3.4 分批发酵生产琥珀酸

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致 谢 26

第一章 文献综述

1.1 琥珀酸的生产研究概况

1.1.1琥珀酸的理化性质

琥珀酸，又叫丁二酸，英文名为：succinic acid ，琥珀酸是三羧酸循环中重要的中间产物，也是某些氨基酸的代谢产物。分子量为118.09,无色有味酸，可燃。通常为无色晶体，有两种晶型，相对密度是1.572(25/4℃).1g琥珀酸溶于以下溶剂中，所需溶剂体积为13mL冷水，1mL沸水，18.5mL乙醇，6.3mL甲醇，36mL甘油和11mL乙醚^[1,2]，不溶于一些有机溶剂，如苯，二硫化碳，四氯化碳和石油醚。丁二酸是二元羧酸，具有二元酸多数的典型反应，由于其分子内含有活泼的亚甲基官能团，因而具有许多其它重要的反应特性，如氧化、还原、脱水、酯化、磺化、卤化、醚化等反应^[3,4]。

图1-1 琥珀酸的构型

1.1.2 琥珀酸的工业应用

琥珀酸主要用于制备琥珀酸酐和一些五杂环化合物，也可以用于制备醇酸树脂（由琥珀酸生产的醇酸树脂具有良好的曲挠性，弹性和抗水性），油漆，染料（琥珀酸的二苯基酯是染料的中间体，与氨基蒽醌反应后生成蒽醌染料），食品调味剂（琥珀酸还可用作食品酸味剂，用于酒，饲料，糖果等的调味），照相材料等。医药工业中可用于生产一些药物，如磺胺类药，维生素A，维生素B，抗痉挛剂，松痰剂，利尿剂和止血药物等。也可作为化学试剂，用作碱量法标准试剂，缓冲剂，气象色谱对比样品。还可用作润滑剂和表面活性剂的原料^[5]。

丁二酸作为C4化合物，可以用于合成许多大宗化学产品如1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料^[6,7]，可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一^[8-10]。作为一种重要的有机酸，琥珀酸在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用，但其真正的潜力是作为大规模工业原料的应用。传统的琥珀酸生产是以不可再生战略资源石油为原料，而目前石油储量在不断减少，价格在不断增长，并且石油工业对环境有很大的负面影响，这促使了琥珀酸生物合成工业的研究和发展^[11-13]。微生物发酵生产琥珀酸以可再生资源糖和二氧化碳等作为主要原料，不仅摆脱了对石油化工原料的依赖，而且可以固定二氧化碳，减少温室气体，绿色环保，具有一定的环境效益。通过发酵法生产的琥珀酸，价格约为0.55~1.10$/kg^[14] ，使得琥珀酸衍生物1,4-丁二醇、四氢呋喃和γ-丁内酯等可以和石油化学产品在生产成本上形成竞争 。

1.2琥珀酸的市场现状和前景

当前，工业级琥珀酸的销售量超过1.5万吨，大体上是通过石化法，从丁烷通过顺式丁烯二酐生产。目前只有食品市场的琥珀酸是发酵生产的。新的发酵工艺能使琥珀酸的销售价格降为2.20美元/kg(年产5000t)，当年产量为7.5万t时，其销售价格将低于0.55美元/kg^[15]，这种价格可使琥珀酸打开新的商品化化学制品市场。美国能源部现已投入700万美元用于琥珀酸发酵法生产工业化的研究，目前已完成中试，将于近期投入生产。琥珀酸存在四种主要的市场：最大的市场是作为表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂；第二个市场是作为离子鳌合剂，用于在电镀行业防止金属的溶蚀和点蚀；第三个市场是在食品行业中作为酸化剂、PH改良剂、风味物质和抗菌剂；第四个市场是和健康有关的产品，包括医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产。琥珀酸的这四个市场总量每年超过四亿美元^[16]。

1.3 琥珀酸的制备方法概述

1.3.1化学合成法

工业制法较多，当前,工业级琥珀酸的销售量超过1.5万吨,大体上是通过石化法制得,原材料使用液化石油气或石油。主要有以下几种：

请支付后下载全文，论文总字数：20756字