论文总字数：19897字

摘 要

谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase）催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨的反应。且谷氨酸脱氢酶是唯一既能利用NAD 又能利用NADH 作为还原当量的酶。是一种不需氧的脱氢酶。经过定点突变(K92V和T195S)的谷氨酸脱氢酶能在辅因子NADPH的存在下作用于产高丙氨酸的代谢过程。L-高丙氨酸是一种非天然氨基酸，它是很多药物合成的手性中间体。因此，大量生产L-高丙氨酸可以降低疾目的和病治疗的成本，同时提高其高效性和安全性。有利于促进生物和医药事业的发展和进步。

本实验采用已有的分子操作方法，从大肠DH5α基因组中克隆得到关键基因gdhA，对GDH进行定点突变为GDH2，将关键基因gdhA导入大肠杆菌中表达，检测酶活。若检测到酶活，则可大量发酵生产L-高丙氨酸。从而为后续高产菌株的分子改造及优化奠定基础。

关键词：谷氨酸脱氢酶 定点突变 L-高丙氨酸

Abstract

Glutamate dehydrogenase (glutamate dehydrogenase) deamination of glutamate catalyzed reaction of α-ketoglutaric acid and ammonia.Glutamate dehydrogenase is the only equivalent to NAD and NADH as restore enzyme.Dehydrogenase is one that does not require oxygen.By site-directed mutagenesis (K92V and T195S), glutamate dehydrogenase in the presence of cofactor NADPH stripped and used to produce high phenylalanine metabolism.L-alanine is an unnatural amino acids, it is a lot of drug synthesis of Chiral intermediates.Therefore, mass production of l-homoalanine can reduce disease purposes and treatment costs, while increasing their efficiency and safety.Conducive to the promotion of biological and pharmaceutical industry develop and progress.

Using existing operationalm ethods,from the large intestine DHα geno cloned key genes gdhA, GDH was performed site-directed mutagenesis ,become GDH 2.The key gene gdhA was imported into escherichia coli,and expressing,detect enzyme activity.If detecting enzyme activity,we can do large high fermentative production of l-homoalanine.To lay the Foundation for subsequent molecular modification and optimization of high-yield strains.

　　Key words: Glutamate dehydrogenase;Site-directed mutagenesis;L-homoalanine

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1谷氨酸脱氢酶 1

1.1.1谷氨酸脱氢酶概述 1

1.1.2 以谷氨酸脱氢酶为中心的联合脱氨基反应机理 1

1.1.3 谷氨酸脱氢酶的主要功能及用途 2

1.2 L-高丙氨酸 2

1.2.1 L-高丙氨酸的结构理化性质及代谢流程 2

1.2.2 L-高丙氨酸的主要功能及用途 3

1.3 基因克隆技术 4

1.3.1基因克隆技术概述 4

1.3.2 基因克隆的原理 4

1.3.3 PCR概述 4

1.3.4 PCR技术原理 4

1.4 定点突变技术 5

1.4.1 定点突变的概述 5

1.4.2 寡核苷酸引物突变 5

1.4.3 重组 PCR 定点突变法 5

1.4.4 盒式突变 6

1.5本课题研究的目的和意义 7

1.6本课题研究的内容和路线 7

第二章 材料与方法 8

2.1实验材料 8

2.1.1 实验菌株和质粒 8

2.1.2 实验培养基和培养方法 8

2.1.2.1 培养基成分 8

2.1.2.2 菌株培养方法 8

2.1.3 工具酶和试剂盒 9

2.1.4 实验仪器 9

2.1.5 实验试剂 10

2.2 实验及分析方法 11

2.2.1 提基因组的方法 11

2.2.2 PCR反应获得基因片段 12

2.2.3 大肠杆菌感受态的制备 13

2.2.5 连接T-载体的连接体系 14

2.2.6 提质粒DNA的方法 14

2.2.8 酶活检测的方法 15

2.2.8.1 蛋白表达 15

2.2.8.2 粗酶液的获得 16

2.2.8.4 蛋白鉴定 16

2.2.8.5 谷氨酸脱氢酶（GDH2）酶活测定 16

第三章 实验结果和讨论 18

3.1 PCR反应克隆目的片段 18

3.2 目的片段与T-载体连接转化并进行双酶切（BamHⅠ和EcoRⅠ）验证 18

3.3 测序正确后，胶回收片段与载体PET-28A连接转化提质粒并进行酶切验证 19

3.4 诱导表达提纯酶，并测酶活 20

3.4.1 蛋白电泳跑胶验证 20

3.4.2 GDH2酶活测定 20

第四章 结论与展望 22

4.1结论 22

4.2展望 22

参考文献 23

致谢 25

第一章 文献综述

1.1谷氨酸脱氢酶

1.1.1谷氨酸脱氢酶概述

谷氨酸脱氢酶( glutamate dehydrogenase,GDH) 是一种依赖辅酶的脱氢酶。是催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨的反应。且谷氨酸脱氢酶是唯一既能利用NAD 又能利用NADH 作为还原当量的酶，是一种不需氧的脱氢酶，它广泛存在于动物、植物和微生物中^[1-3]。

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