论文总字数：18668字

摘 要

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶是一种具有广泛底物特异性的新型手性拆分酶源，在医药、农林等领域都有应用。本论文以高表达NAOase的重组DH10B/argE-pHsh为研究对象，首先筛选了活力较高的菌株并以冻存管法留种，再扩培热激得高活力酶细胞。研究了金属离子对乙酰鸟氨酸脱酰基酶的催化机制及结构的影响,乙酰鸟氨酸脱酰基酶 的电泳法微量纯化,溶出蛋白的条件确定,离子染色及胶回收。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，得到目的条带，并回收。

关键词：N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶 金属离子 高活力菌株 催化 电泳纯化

ABSTRACT

The N-acetyl-L-ornithine deacetylase (NAOase, EC3.5.1.16) is a new chiral separation enzyme source, which has relatively broad substrate specificity and applications in the fields of medicine, agriculture and forestry. In this paper，the recombinant DH10B/argE-pHsh which can highly express NAOase was regarded as the object of study. Four metal ions were chosen to investigate their effects on the growth of recombinant bacteria and the enzyme expression activity under different culture conditions.Contentincludes:screening of high activity and vials seed, effect of metal ions on acetyl ornithine decarboxylase catalytic mechanism and structure,acetyl ornithine decarboxylase of electrophoresis miniprep,protein elution conditions determined ion dyeing and plastic recycling.By PAGE electrophoresis,to give the strip and recovered.

KEYWORDS: N-acetylornithine deacetylase；Metal ion；High dynamic strain；Catalytic; Electrophoresis purification

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第1章 绪论 1

1.1 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶研究进展 1

1.1.1 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的来源 1

1.1.2 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的的基因序列研究 1

1.1.3 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的酶学性质 2

1.1.4 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的研究历程 2

1.1.5 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶在农林业上的应用 2

1.1.6 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的研究历程 3

1.2 研究目的 3

1.3 研究内容 3

第2章 实验材料及方法 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 主要试剂及其来源 4

2.1.2 主要仪器设备及其来源 5

2.1.3 实验菌种 6

2.1.4 培养基 6

2.2 实验方法 6

2.2.1高活力菌株的筛选 6

2.2.2 冻存管保藏的过程和方法 7

2.2.3 金属离子对酶活力的影响 7

2.2.4 酶的微量电泳法纯化 7

2.2.5 金属离子对乙酰鸟氨酸脱酰基酶的催化机制及结构的影响 8

2.3 分析方法 9

第3章 实验结果与讨论 14

3.1 高活力菌株的筛选和冻存管留种 11

3.2 金属离子对乙酰鸟氨酸脱酰基酶的催化机制及结构的影响 12

3.2.1 转化体系中的Co² 对乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性的影响 12

3.2.2 转化体系中的Mn²离子对乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性的影响 13

3.2.3 转化体系中的Zn² 对乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性的影响 14

3.2.4 转化体系中的Mg² 对乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性的影响 15

3.3 乙酰鸟氨酸脱酰基酶的电泳法微量纯化 17

3.3.1 溶出蛋白的条件确定 18

3.3.2 蛋白胶回收 18

第4章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 23

第1章 绪论

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶在精氨酸合成中，参与催化第五步反应。该酶兼有肽酶和乙酰酶的活性^[2]，其催化的反应式为：

该酶最初被命名为乙酰鸟氨酸酶（acetylornithinase），最后被规范命名为N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶（N-acetylornithine deacetylase，简称NAOase；EC3.5.1.16）。

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶是一种具有广泛底物特异性的新型手性拆分酶源，在医药，农林等领域都有应用。用基因工程菌表达的脱乙酰基酶酶法拆分活性更高，酶源易得，成本更低。随着人类自身需求的增加和科技的发展，氨基酸的应用领域被不断衍生。具有光学活性的手性氨基酸，在蛋白质多肽合成、有机化学不对称合成以及医药、食品、卫生等领域具有重要意义。

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶（N-acetylornithine deacetylase，简称NAOase；EC3.5.1.16）就是一种较为有效地拆分手性氨基酸的酶。用基因工程菌表达的脱乙酰基酶酶法拆分活性更高，酶源易得，成本更低，原则上拆分效能更好。

1.1 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶研究进展

1.1.1 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的来源

1956年，Bonner等人在大肠杆菌中发现了N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的存在。Thierry等报道在E.coli中，argE基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶能将乙酰鸟氨酸转化成乙酸和鸟氨酸。1992年，Thierry Meinnel首次从大肠杆菌中分离得到argE基因，并发现该酶与3种已知的具有氨基酰化酶活力的酶有很高的序列同源性。

随着分子生物学和基因工程的快速发展，迄今为止，已经在细菌、真菌、霉菌等多种微生物中以及动植物中鉴定出N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。

1.1.2 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的基因序列研究

Thierry Meinnel等测出了E.coli中包括argE在内的2100bp的基因簇，其中PPC-argE基因包括6个重复的REP序列。在大肠杆菌基因图谱中显示oxyRargE基因的表达操纵子。序列中有3个可能的起始密码子，于是采用定点突变的技术确定了第3个ATG是表达argE的起始密码子。argE基因含有1400bp，编码分子量为42，350Da的多肽。此研究从遗传学上揭示了该酶的基因序列，为进一步研究该酶的催化机制及结构奠定良好的理论基础。

1.1.3 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的酶学性质

Bonner等发现N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶并对其简单纯化，初步研究了该酶的酶学性质，发现有Co² 离子及谷胱苷肽对该酶有促进作用，而Cu² 、Zn² 、Ni² 、EDTA及对氯高汞苯甲酸盐对该酶有抑制作用。Farah等详细研究了该酶的底物特异性，进一步研究发现该酶具有很强的立体异构性。它只能作用于α-N-酰基-L-氨基酸，而不能水解N-乙酰-D-氨基酸和芳香族氨基酸及酸性氨基酸。因此带有正电荷的侧链是N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶较好的底物。通过对K_cat/K_m的比较，N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的最适底物是α-N-乙酰-甲硫氨酸和α-N-甲酰-甲硫氨酸。

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