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通过实时聚合酶链反应评价阿昔洛韦和/或羊膜对疱疹病毒培养和定量病毒活动的影响

1.眼科部，法提赫大学医学学院，伊斯坦布尔34188，土耳其

2.病毒学、安卡拉大学兽医学院，伊尔凡,06110安卡拉，土耳其

3.眼科部，嘎子大学医学系，安卡拉06500，土耳其

作者简介：费里德-艾林-凯特兹。法提赫大学眼科医学系，伊斯坦布尔，34188，土耳其。ferideaylin@gmail.com

接收时间：2013-06-24 接受认可时间： 2013-09-13

摘要

目的：探讨羊膜在疱疹病毒细胞培养与实时聚合酶链反应（RT-PCR）中对阿昔洛韦的渗透性。

方法：牛肾细胞（MDBK）培养和牛疱疹病毒1型（BHV1）在研究中被使用。在在单纯疱疹病毒接种的基础上，将细胞培养分为2种。每一组被分为三种。人羊膜（V-HAM）、阿昔洛韦（V-A），人羊膜和阿昔洛韦（V -HAM-A）被分别应用到这些子群培养中。在膜和药物的应用后，用组织培养显微镜分别观察培养24小时和48小时后，细胞的病变效应（CPE ）。在CPE（ ）样本，提取DNA并且用逆转录聚合酶链反应来分析检测病毒DNA。

结果：在没有疱疹病毒控制的培养中CPE没有被检测到。此外，羊膜和阿昔洛韦并没有对培养细胞产生细胞毒作用。 CPE在S型- 1接种细胞培养羊膜和/或阿昔洛韦的应用后被检测到。应用逆转录聚合酶链反应的DNA分析表明，循环阈值（CT）值在牛疱疹病毒1型和羊膜的应用的D组中较低（羊膜组lt;阿昔洛韦组lt;膜和阿昔洛韦组）。这说明膜没有抗病毒作用。高CT膜细胞培养组和阿昔洛韦值表明，膜对于药物具有渗透性和低屏障作用。

结论：在我们的体外研究中，我们发现，羊膜，可用于角膜疾病的治疗，没有抗病毒作用。此外，我们检测到羊膜对阿昔洛韦接种MDBK牛疱疹病毒1型的细胞培养具有渗透性。然而，更多的研究对于探讨羊膜和无环鸟苷的定量影响是必要的。

关键词：阿昔洛韦；羊膜；单纯疱疹病毒

关键点：奥孜库尔A，阿卡塔F.评价阿昔洛韦和/或羊膜对疱疹病毒培养和定量病毒的影响实时聚合酶链反应活性。眼科杂志2014；7（4）：626-631

简介

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染是角膜盲[1-3]的最常见的原因之一。HSV-1感染通常是基于临床发现。另一方面，临床和病毒实验室研究之间的密切关系，可以帮助识别可疑病例 。近年来，分子诊断方法的发展，如高度敏感的聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR（RT-PCR），有利于早期诊断和治疗决定。这些方法被应用广泛是由于他们对HSV-1的诊断灵敏度高，因为他们可以被用来同时评价多个试样，并且他们提供更快速的结果。

单纯疱疹病毒引起的眼部感染可被多种抗病毒药物治疗，如阿昔洛韦、外用皮质激素可以应用在需要的时候[ 7 ]。人羊膜（HAM）被越来越多地应用于眼科领域。对于严重的疱疹性角膜感染，人羊膜可以替代角膜移植手术，当药物治疗失败，或可应用于药物治疗的组合中[8,9]。在这项研究中，牛肾细胞传代接种后（MDBK）与牛疱疹病毒1型细胞培养（BHV-1），伴随阿昔洛韦和/或羊膜的应用，病毒载量用逆转录聚合酶链反应进行检测。阿昔洛韦、羊膜细胞对病毒培养的影响可以被评估出来。

材料与方法

参考菌株和牛肾细胞传代接种后细胞培养的牛疱疹病毒1型细胞培养（BHV-1），是在安卡拉大学兽医学院病毒学部门的库存，被有效地用于研究逆转录聚合酶链反应对体外阿昔洛韦和羊膜的影响。牛疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒1型，是类似病毒的alpha;疱疹病毒亚科的成员。它们具有相同的基因组和生物学特性。牛疱疹病毒1型在动物身上导致和单纯疱疹病毒1型相似的感染[ 10 ]。

工作组安排

本研究中所用的羊膜是从含有肝炎病毒类型B-C， HIV的怀孕者阴性的体中获得的。 胎盘被清除的致命的废物和血凝块的平衡盐溶液含有青霉素（50mu;米/毫升）和新霉素（100mu;米/毫升）。羊膜和绒毛膜被剥离分开，然后绒毛膜的部分被删除。

结果羊膜被铺在无菌硝化纤维纸表面上皮上，基质基质粘附于纸张的表面。 这个无菌的硝酸纤维素纸被切成5厘米片状，在80℃下被储存在含有角膜存储解决方案和甘油的比例为1:1的培养皿中。该制剂在在研究10分钟之前进行室温加热以迅速解冻。

对于牛肾细胞，培养基（含10%胎牛血清的DMEM培养液）（FCS）作为生长培养基，并含有2%小牛血清的DMEM作为存储介质。准备500毫升的DMEM培养液，50毫升的FCS中加入10毫升生长介质和10毫升的FCS中加入10毫升链霉素青霉素溶液为存储介质。牛肾细胞培养已经准备储存冷冻在80℃下，永久传代很快融化在37℃水浴中。

解冻后，将牛肾细胞培养物置于适合他们细胞系的媒体培养。细胞被储存在一个孵化器中，直到它们产生一个单一的细胞层。为了消除培养基中的死细胞，培养基被10% FCS取代。细胞在6孔培养板连续培养，细胞培养后，细胞的密度为100000个每1毫升，将3毫升1000毫升DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）和CMC（羧甲基纤维素）被添加到每个作为生长介质。在这项研究中，我们优选了一种非特异性吸附方法以接种病毒到培养的细胞中由于其高滴度。6孔培养板分为两组。 在第一组中，牛疱疹病毒1型被分为三小组栽培。我们使用了一个1 / 100稀释每个瓶子和一个非特异性吸附方法。

A. HAM被覆盖在生长培养基（维翰）。

B.在覆盖HAM后、3%无环鸟苷被应用于膜。

C. 阿昔洛韦被应用于细胞和病毒培养（V-A）。

为了探讨羊膜和阿昔洛韦对细胞的影响，病毒培养没有进行只包含牛肾细胞的第二组。 从第二组三小组的6孔培养板的制备如下：

A. HAM被覆盖在细胞培养基（C-HAM）。

B. 在将细胞培养基覆盖于膜后，应用3%无环鸟苷（C-HAM-A）。

C. 该药物只适用于细胞培养基（C-A）。

在应用后，细胞培养的培养皿被放在37℃的含有 5%二氧化碳的环境中孵育48h。在接种24和48h后，需要用一个检测细胞病变效应（CPE）的培养显微镜来检查组织。DNA提取是细胞出现CPE进行以及来自其他小组的细胞。评估后通过逆转录聚合酶链反应测量病毒载量来测量羊膜和阿昔洛韦对病毒和细胞的影响。

实时聚合酶链反应

在这项研究中,“转基因6000（柯必特研究、澳大利亚）的“实时设备和探针是根据“病毒的定性检测，是荧光5核酸酶法”的应用。逆转录聚合酶链反应，黑洞和病毒试剂盒（恰基公司，德国）和病毒的引物和探针被使用于疱疹病毒的诊断。该型设计的引物和探针被专门用于研究。

引物和探针指标：

引物1： 5-AGCTCCGGTTCTACGACATTG-3

引物2：5-CCCAGGCCCTGAAAGAAGTTG-3

探针：FAM-CGTGGTCAAGACGGACGGCAATA-BHQ1

这对引物扩增了BHV-1糖蛋白B基因90nt区。反应进行的总体积为25微升.

放大反应的组合物如下所示。

对于预放大， 在95摄氏度下变性4min之后, 标本用45倍位处理进行热循环（95℃为60 1和55℃）。荧光检测在55摄氏度下变性并且在每个周期都延伸。

一个放大图被用来收集核酸定量检测所需的研究信息。该断层扫描（周期阈值）是一个重要的参数，用于定量和表示的周期数，在该周期数达到和荧光发射的荧光。对数线性期的荧光随兼容的指数增长而增加[11,12]。

在稀释10-1、10-2、10-3和纯病毒对照组中对病毒标本RT-PCR分析。标本的扫描量与浓度成比例增加（图1）。样品的荧光传输根据指数阶段的浓度而减小。

通过使用已知浓度的稀释的标准系列绘制一个标准曲线，并进行准确的定量。 标准曲线显示了其与病毒载量之间的线性关系。 CT值之间的线性关系和浓度a由标准曲线图（图2、表2）确定。除此之外，当BHV-1 DNA浓度的增加,明亮的扩增条带在琼脂糖凝胶从右到左增加（图3）。

结果

这项研究由安卡拉大兽医系的教师带领，病毒学部分和实验重复六次。前三个实验的结果是相似的；在电镀24和48h后，通过 RT-PCR从I组和II组进行RT-PCR检测细胞，提取DNA。

在24、48h后，用组织培养显微镜观察牛疱疹病毒1型感染的牛肾细胞；

A.只有人膜被添加到培养皿，CPE（ ）（A-HAM）被观察到（图4）。

B.3%无环鸟苷被应用于HAM和膜，CPE（ ）（V-HAM-A）被观察到（图5）。

C.3%无环鸟苷被应用于培养皿（ ），CPE（ ）被观察到（V-A）（图6）。

表1 RT-PCR试剂和化合物的混合物

组反应 体积（micro;L）

DNA 3

10xReaction Tampon 2.5

MgCl 2.5

dNTP (10Mm) 0.5

主要物质1 1

主要物质2 1

探针 0.8

Hotsart Maxima Taq 0.3

DNA 聚合酶.

无菌蒸馏水 13.4

总计 25

图1 在RT-PCR分析的放大图10-1、10-2、10-3稀释和纯病毒的浓度。

图2 用检测病毒浓度稀释分析生成一个标准曲线图。

当用 培养显微镜进行CPE（ ）组织细胞培养时，很明显，在24小时时观察到的细胞毒性在48小时时增加，带上细胞却在此背景中下降（图4-6）。

分别观察3小组的6孔培养板的病毒载量，采用RT-PCR从这些细胞中的提取病毒DNA进行计算.

我们评估了阿昔洛韦渗透穿过羊膜的能力，，以及羊膜的抗病毒作用和阿昔洛韦的效果。根据上图所示的图中所示的值， 治疗的效果依次为： V-HAM＜V-A＜V-HAM-A（图7）。所有余下的样本（不包括正控制）

图3 （0.7%）RT-PCR进行琼脂糖凝胶图像

图4 CPE（ ）状态：V-A 在第24h下的状态；B：CPE（ ）在48小时后的V-A下的状态。

没有发现牛疱疹病毒1型的DNA。 样品的V-HAM和阳性对照（PC）组有相同的CT值。 由于病毒复制的结果，低的断层值显示高的脱氧核糖核酸。 然而，V-HAM被观察到更强烈的信号类似的价值观表明，羊膜对病毒复制无影响。

图5 CPE（ ）状态：V-HAM 24h；B：48h。

V-A 和v-ham-a样品比由于DNA负荷的降低，PC样品高CT值和较少的荧光。

并且结果表明：它处理对膜没有影响。另一方面，由于在v-ham-a治疗膜屏障活性， 我们预计，病毒DNA载量比V-A样本少。

因此， CT值被预测得更高（图4）。 然而，很难评估由于晚进入两周期在V-HAM-A中样品膜的影响。我们建议应增加实验的数量，进一步分散时间点。 为了探讨羊膜和阿昔洛韦对细胞的影响，我们有没有在其中只包含牛肾细胞的第二组病毒培养控制。

A.只有HAM被应用到培养皿。CPE（-）（C-HAM）（图8）。

图6 CPE（ ）图像：V-HAM-A 24h；B：48。

图7 组1和组2的RT-PCR扩增分析图

图8 CPE的显微图像（-）。

B.阿昔洛韦用于HAM。CPE（-）（C-HAM-A）（图8）。

C.只有阿昔洛韦应用到培养皿中，CPE（-）被观察到（C-A）（图8）。

CPE（ ）没有在第二组培养板中被观察到， 羊膜和3%阿昔洛韦的应用没有在牛肾细胞里面产生细胞毒作用。荧光发射没有通过阈值线，显示没有病毒载量进入复制循环的C-HAM，C-A和C-HAM-A样品（图7）。

讨论

为了控制HSV引起的威胁视力的眼部感染， 早期诊断和有效的治疗是非常重要的[ 13 ]。具体的和快速的实验室检查，应该被应用于眼疱疹感染的诊断[ 14 ]。新开发的RT-PCR技术允许特定病毒的检测与全自动封闭系统，低污染的风险，比PCR短时间。RT-PCR可以检测和量化很少量的特定核酸序列[15-17 ]。RT-PCR是疱疹性眼病的基于HSV的DNA 量化诊断的一种有效方法[18-21]。

据报道，羊膜已成功用于单纯疱疹

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