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注射用生物降解型PLGA-PEG-PLGA温敏性共聚物的合成及共聚物组成对共聚物基水凝胶药物释放的影响

Mingxi Qiao, Dawei Chen, Xichen Ma, Yanjun Liu

摘要

可注射的可生物降解的温敏性的聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯-乙交酯（PLGA–PEG–PLGA）三嵌段共聚物中丙交酯/乙交酯的摩尔比介于6/1~15/1，是以丙交酯、乙交酯和聚乙二醇的单体合成并由1H NMR 表征。所得到的共聚物在室温下可溶于水中形成自由流动的流体，在体温下则成为水凝胶。共聚物的疏水性随丙交酯/乙交酯的摩尔比增加而增加。通过两种疏水性不同的药物（5-氟尿嘧啶和吲哚美辛）的体外溶出试验来研究丙交酯/乙交酯的摩尔比对药物释放的影响并阐明药物释放的机制。亲水性5-氟尿嘧啶的释放机制为扩散控制，而疏水性的吲哚美辛则呈现出两相的特征，包括初始扩散控制的阶段和水凝胶溶蚀为主的阶段。丙交酯/乙交酯的摩尔比对药物释放的影响似乎是取决于药物释放机制，对在扩散控制阶段中的药物释放几乎没有影响，但在水凝胶溶蚀控制阶段影响显著。与Regel系统相比，所合成的共聚物显示出更高的凝胶化温度和更长的药物释放期。该共聚物可以溶解疏水性吲哚美辛，使其溶解度与在水中（4微克/毫升，25℃）相比增加3425倍（13.7毫克/毫升）。物理混合法和溶剂蒸发法两种方法用于药物增溶，后一种方法具有更高的增溶效率。

关键词：温敏性; 注射;药物释放;水凝胶

1. 前言

在过去的十年中，温敏性聚合物作为载体的可注射药物传递系统越来越受到关注。这些聚合物能够对很小的温度变化刺激作出反应并通过溶胶-凝胶（sol-gel）相转变形成物理交联水凝胶。一种三嵌段共聚物（泊洛沙姆）由聚氧乙烯和聚氧丙烯组成在水溶液中表现出可逆的sol-gel相转变(Brown et al., 1991)。泊洛沙姆407凝胶已用于几种药物的持续递送，包括三十肽alpha;-促黑素细胞激素（MT-I）(Bhardwaj and Blanchard, 1996)，和丝裂霉素C(Miyazaki et al., 1992)，白介素-2(Johnston et al., 1992)和尿素酶(Fults and Johnston, 1990)。泊洛沙姆407凝胶中人体生长激素(rhGH)在体外可持续释放60-72小时，在体内通过肌内和皮下注射可持续释放一周(Manohar et al., 1997)。泊洛沙姆水凝胶不仅可以使药物缓释同时也增强了药物的稳定性(Wang and Johnston, 1995; Katakam et al., 1995)。泊洛沙姆凝胶中药物的释放速率可以通过加入其他试剂进行调节，例如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素和聚己内酯。但是，泊洛沙姆是不可生物降解的，并且形成的水凝胶在注射部位至多几天就会溶解。此外，高浓度（gt;16％，W / W）的泊洛沙姆可能会产生毒性，尤其是用于腹腔内时(Wout et al., 1992; Johnston and Palmer, 1993)。新型的可注射可生物降解的聚合物被报道具有反向胶凝性质(Cha et al., 1997; Jeong et al., 1997; Rathi et al., 2000; Rathi and Zentner, 1999)。这些共聚物是由A块和B块组成ABA型或BAB型三嵌段共聚物，其中A是聚乙二醇（PEG）和B是聚丙交酯 - 乙交酯（PLGA）。它们在室温或低于室温时可溶于水，在注射部位则转变为水凝胶，经过 4-6周缓慢降解(Jeong et al., 1999)。由于聚合物是可生物降解的，所有当贮存的药物释放完成后便不再需要额外的载体将这些聚合物移除。包括蛋白质类药物和紫杉醇在内的多种药物从PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水凝胶（ReGelreg;）释放已经有文献报道(Zentner et al., 2001; Kim et al., 2001)。ReGel是PEG分子量为1000，丙交酯/乙交酯摩尔比为3的PLGA-PEG-PLGA共聚物的商品名，该共聚物可以溶解难溶性的紫杉醇，使蛋白质类药物稳定，使药物在1~6周持续释放共聚物组合物的效果。然而，迄今为止，未有关于共聚物组成对所载药物释放的影响的报道。

在本文中,首次合成了丙交酯/乙交酯不同摩尔比（介于6/1~15/1）的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物并发现了这些共聚物具有热可逆凝胶特性，对不同摩尔比的丙交酯/乙交酯对从共聚物基水凝胶和水凝胶溶蚀中释放的药物的影响进行研究，并把这些药物释放的数据与从ReGel系统中所获得的结果相比。此外，对共聚物胶束中的疏水性药物的增溶方法进行了探讨。

1. 材料和方法

2.1材料

聚乙二醇（PEG1500）──上海浦东高南化工股份有限公司；丙交酯和乙交酯──中国康复研究中心康安高分子开发中心并且不经进一步纯化而使用；异辛酸亚锡──Sigma（US）；5-氟尿嘧啶──安徽sinoi植入高新技术科技有限公司；吲哚美辛──中国北方药业有限公司。

2.2 PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的合成

氮气氛中，真空条件下将聚乙二醇1500置于三口烧瓶中在120℃搅拌干燥2小时。称取一定比例的共50g的丙交酯、乙交酯和PEG聚合化。共聚反应完成时有不同的丙交酯/乙交酯摩尔比(6/1, 10/1, 15/1)，PEG的质量比为30% (w/w)。取异辛酸亚锡（0.2％，W / W）加入到严格干燥的聚合管中，接着加入丙交酯、乙交酯和PEG。然后将聚合管在真空下密封，将密封管置于150℃恒温油浴中8小时。将制得的粗产物溶解在水中使共聚物沉淀，除去水溶性的低分子量的聚合物及未反应的单体。上清液倾析，得到共聚物的沉淀。该过程重复三次，以纯化共聚物。将所得到的共聚物在室温下真空干燥，直到恒重。不同共聚物命名为PLGA-PEG-PLGA（X / Y），其中X/ Y是丙交酯和乙交酯的摩尔比。

2.3 凝胶过滤色谱（GPC）表征

PLGA-PEG-PLGA共聚物的分子量用Shimadzu LC-10AD高效液相色谱泵和Shimadzu RID-6A示差折光检测器(Kyoto, Japan) 耦合到Hewlett Packard Plgel系列色谱柱的GPC仪器进行测定，四氢呋喃作为溶剂，流速为1毫升/分钟。共聚物分子量的测定以聚苯乙烯为标准品。

2.4 1H核磁共振氢谱（1H-NMR）表征

用Bruker ARX-300在300MHz、CDCl3中获取PLGA-PEG-PLGA共聚物的1H-NMR谱，丙交酯和乙交酯的摩尔比由1H-NMR谱获得。

2.5 凝胶化温度的测定(Yong et al., 2001)

在一个20毫升透明小瓶中放入2.6克磁棒（圆柱形，10times;5mmi.d.）和10g PLGA-PEG-PLGA共聚物水溶液，将小瓶置于水浴中，保持在恒定速率（200rpm）下搅拌，水浴以 2℃/分钟的恒定速度进行加热。当磁棒由于溶液凝胶化停止搅拌时，从温度计读取的温度即为凝胶化温度。

2.6 吲哚美辛通过PLGA-PEG-PLGA共聚物的增溶

2.6.1 溶剂蒸发法(Lavasanifar et al., 2001)

在圆底烧瓶中，将过量吲哚美辛和PLGA-PEG-PLGA共聚物溶于丙酮。在真空50℃下将丙酮除去，丙酮完全除去后，加入蒸馏水将药物与共聚物形成的薄膜溶解（25％，W / W）。将悬浮液离心10分钟，用高效液相色谱法分析上清液中的吲哚美辛浓度。对于色谱条件，请参见2.8节。

2.6.2 物理混合法

将过量吲哚美辛和PLGA-PEG-PLGA共聚物溶液涡旋混合30s，在25℃水浴中震摇使溶解达到平衡。将悬浮液离心10分钟，用高效液相色谱法分析上清液中的吲哚美辛浓度。

2.7 制备载药PLGA-PEG-PLGA共聚物溶液

将PLGA-PEG-PLGA共聚物溶解在含有5-氟尿嘧啶的蒸馏水中制得载药量0.5％（W / W）的25％（W / W）的共聚物溶液。吲哚美辛以相同的载药量使用溶剂蒸发法被纳入PLGA-PEG-PLGA共聚物中。

2.8 体外溶蚀研究

将共聚物溶液（25％，w / w，1毫升）置于试管中，保持37℃恒温。2分钟后，加入释放介质磷酸盐缓冲液（pH 7.4）3ml，释放面积为0.50cm2，转速为50rpm。在采样时间，将每个试管中的释放介质转移到预先称过重量的小瓶中并蒸发溶剂至恒重。共聚物的溶蚀量按下式计算：Wd-Wo-Wp，式中Wd是干燥后的小瓶的重量，Wo为小瓶的原始重量，Wp为磷酸盐的重量。

2.9 体外释放研究

根据2.8节得到含有模型药物(1 ml)的共聚物溶液。在预定的时间，用相同量的新鲜缓冲液代替释放介质来保持沉落条件并进行高效液相色谱 (HPLC)分析。HPLC(SPD-10Avp, Shimadzu)(5mu;m particle, 150times;4.6mm i.d., DiamonsilTM)分析中，5-氟尿嘧啶的流动相为甲醇-水，比例为5:95（v/v）；吲哚美辛的流动相为甲醇-醋酸钠无水缓冲液（20mM，pH 4.6），比例为80:20（v/v）。用紫外 - 可见光分别在265nm和320 nm处对5-氟尿嘧啶和吲哚美辛进行分析，流动相的流速为1毫升/分钟。数据由模型依赖方法评价。药物从聚合物基质扩散可以由式（1）进行说明。该方程根据Mt/Minfin;的值可以简化为式（2）或式（3）：

其中，Mt为药物在时间t的释放量，Minfin;是释放时间接近无穷大时药物的释放量，而D和l分别是药物的扩散系数和装置的厚度。

2.10 统计

在各个不同体积使用单向方差分析法统计分析丙交酯/乙交酯的摩尔比增大时(6/1, 10/1, 15/1)对溶胶化温度、溶蚀和药物释放速率的影响。在所有情况下，个别的装置的事后比较用Tukey的显著差异测试进行，P lt;0.05有意义。

3. 结果

3.1 PLGA–PEG–PLGA三嵌段共聚物的表征

PLGA-PEG-PLGA共聚物的特征波谱示于下图1。 1.出现的特征信号5.2，4.8，3.6和1.5 ppm处分别是丙交酯单体的次甲基氢，乙交酯单体的亚甲基氢， PEG的亚甲基氢和丙交酯单体的甲基氢。分子量，丙交酯/乙交酯的摩尔比和共聚物的多分散指数示于表1。

3.2 PLGA-PEG-PLGA共聚物溶液的胶凝温度

PLGA-PEG-PLGA（6/1）共聚物的水溶液的凝胶化行为的特征相图示于图2。各种不同浓度的共聚物溶液的凝胶化温度示于图3。共聚物（6/1，10/1，15/1）的浓度从15％（w/w）增加至25％（w/w）时，溶液凝胶化的温度分别从36.2℃减少至31.2℃，35.4℃减少至30.2℃，34.5℃减少至29.5℃。丙交酯/乙交酯的摩尔比从6/1增加至15/1时，共聚物溶液的凝胶化温度也随之增加。在不同的浓度水平，三种共聚物的凝胶化温度有显著差异（P lt;0.05）。

3.3 水凝胶的体外溶蚀

图4显示了丙交酯/乙交酯的摩尔比对共聚物的溶蚀的影响，与PLGA-PEG-PLGA（6/1）共聚物相比较，PLGA-PEG-PLGA（15/1）共聚物在第15天至第22天的溶蚀量显著较低。

3.4 体外药物释放研究

图5和图6分别为5-氟尿嘧啶和吲哚美辛从PLGA-PEG-PLGA（6/1，10/1和15/1）基共聚物水凝胶的释放曲线。在5-氟尿嘧啶和吲哚美辛的初始释放阶段二者的释放速率没有显著差异（Pgt; 0.05）。在第15天至第22天，PLGA-PEG-PLGA中丙交酯/乙交酯的摩尔比为6/1与15/1相比，吲哚美辛释放速率有显著差异（P lt;0.05）。图7和图8分别是载药量为0.5％（W / W）时，5-氟尿嘧啶和吲哚美辛从PLGA-PEG-PLGA（6/1）基共聚物水凝胶和ReGel释放情况的对比，其中，共聚物的浓度均为25％（W / W）。PLGA-PEG-PLGA基共聚物水凝胶表现出显著低于ReGel的药物释放速率。

3.5 药物释放机制

5-氟尿嘧啶和吲哚美辛初始阶段的释放速率拟合成方程 （2）及方程（3），相关系数示于表2。在后期释放阶段（10-30天），针对累积溶蚀量绘制的吲哚美辛的累积释放特征图见图9。

4 讨论

4.1丙交酯/乙交酯的摩尔比对水凝胶溶蚀和药物释放的影响

聚合物体系的热可逆胶凝现象众所周知。水凝胶的形成需要两个看似矛盾的条件：链间相互作用要足够强以在水凝胶网络中形成结点，但同时链条不能排除溶剂，否则它将在水中沉淀，而不是形成水凝胶。

温敏性PLGA-PEG-PLGA共聚物是一种由疏水PLGA段和亲水PEG段组成的嵌段共聚物，其中，PLGA段形成关联交联点，PEG段则使得该共聚物分子能稳定存在溶液中。在较低温度下，共聚物链中的亲水性PEG链段和水分子之间的氢键在水性溶液中占主导地位，使得它们在水中溶解。随着温度的升高，氢键变弱，而疏水性PLGA链段间疏水力加强，导致溶胶 - 凝胶转变，由于丙交酯比乙交酯更难溶于水，当丙交酯/乙交酯的摩尔比增加时，共聚物PLGA-PEG-PLGA（6/1，10/1，15/1）的疏水性依次增加，丙交酯/乙交酯的摩尔比较大的共聚物分子间具有强疏水相互作用，可以形成更稳定水凝胶。这可以通过水凝胶的体外溶蚀试验进行验证。水凝胶溶蚀的速率取决于丙交酯/乙交酯的摩尔比，随丙交酯/乙交酯的摩尔比从6/1到15/1的提高（参照图4）而降低。溶胶 - 凝胶转变温度的降低（参照图3）也指出，随丙交酯/乙交酯摩尔比增加，共聚物分子之间的疏水相互作用也增加。<!--

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