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关键词 细胞凋亡 茵陈蒿花 茵陈二炔酮 精油 HL-60细胞

氨基末端激酶

摘要

背景：天然药物是药物疗法最重要的药物来源之一，通过寻找人类白血病HL-60细胞的新型抗癌药物，以及对几种天然药物的筛选，我们确定了茵陈篙花精油中细胞凋亡诱导活性的组分。

方法：通过甲基四氮盐法对人白血病HL-60细胞提取物的细胞毒性进行评估，通过对基因片段和核形态变化进行细胞诱导凋亡研究，植物名称在植物名录网站上进行核对。

结果：一个来自茵陈篙的花的精油部分的纯化复合物被确认为茵陈二炔酮，它能有效抑制人白血病HL-60细胞的生产。茵陈二炔酮在细胞中的毒素效应与细胞凋亡有关，当HL-60细胞用10^minus;6 M 茵陈二炔酮处理 6 小时后，DNA分裂和核分裂等细胞凋亡特征就能被观察到。此外，在细胞凋亡的特征出现之前用茵陈二炔酮处理，能够检测到氨基末端激酶的活性，同时在用茵陈二炔酮处理过的HL-60细胞上也能观察到线粒体细胞色素C的释放。

结论:茵陈二炔酮可能对氨基末端激酶的信号进行控制，通过线粒体凋亡通道诱导HL-60细胞凋亡，我们的结果表明, 茵陈二炔酮可能是一个潜在的可以提高治疗效果的有用抗癌药物。

绪论

尽管癌细胞通常不分化或凋亡，他们可以被某些化学药剂诱导分化和凋亡,被用于治疗癌症的各种化疗剂，如阿霉素、顺铂和紫杉醇已报告有细胞凋亡诱导活性。肿瘤细胞的诱导凋亡已经成为抗癌药物效果的一项指标,具有很强的凋亡诱导活性的化学药剂预计有潜力作为抗癌药物。我们已经确定了肿瘤细胞凋亡和分化的一系列诱导物，其中包括类异戊二烯化合物，如诱导剂戊四烯酮，香叶基香叶醇和维生素K2，以及拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱和依托泊苷。

凋亡是受多种信号通路,包括有丝分裂原活化蛋白激酶超家族的成员控制调节的，SAPK和p38也被称为应激活化的蛋白激酶,是由一些细胞外的刺激激活的,如紫外线、TNF-alpha;以及渗透压休克。诱导凋亡是由多种细胞外压力和信号诱导激活的, 例如通过除去神经生长因子来诱导已分化的PC12细胞凋亡和通过神经酰胺治疗来诱导U937细胞凋亡。对于由拓扑异构酶抑制剂beta;-拉帕醌诱导凋亡的细胞 HL-60内，只有氨基末端激酶而不是P38被激活,后续观察到被激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。在目前的研究中,我们调查了茵陈蒿花的挥发油部分中导致人类白血病HL-60细胞凋亡的细胞内信号通路。

艾属物种被用作食品添加剂和传统草药,特别是在治疗疾病比如癌症、炎症、疟疾、肝炎、和微生物感染，这些物种中，茵陈蒿的花自古以来已被用来作为一种重要的生药（日文名为“chinko”），显示出各种药理作用，包括抗炎，抗过敏和抗癌活动，最近，在医疗中挥发油成分的使用已经引起越来越大的关注，因为已经有报告表明挥发油有潜在的化疗预防作用，它能通过诱导作用使肿瘤细胞系中的部分细胞凋亡。这些观察表明茵陈蒿花的挥发油部分可能是有益的癌细胞凋亡诱导剂。在目前的研究中,我们发现茵陈蒿挥发油的各种化合物成分中，茵陈二炔酮具有最强的细胞凋亡诱导活性。茵陈二炔酮是艾属物种的挥发油成分中的基本组成部分,并显示出重要的生物活性,如抗肿瘤、抗菌、抗菌和抗真菌活性。我们还证明了茵陈二炔酮对氨基末端激酶和应激活化蛋白激酶产生了强烈的诱导作用，并且没有激活丝裂原活化蛋白激酶家族其他酶类，例如细胞外信号调节激酶。本文详细介绍了茵陈二炔酮诱导HL-60细胞凋亡的特点。

试剂与方法

试剂、细胞系与细胞培养

依托泊苷和甲基四氮盐是从Sigma公司购买的，磷酸化应激活化蛋白激酶和氨基末端激酶鼠源性单克隆抗体，应激活化蛋白激酶和氨基末端激酶(56G8)兔单克隆抗体、磷酸化的p44/42 丝裂原激活的蛋白激酶 (Thr202/Tyr204) 抗体、以及p44/42 丝裂原激活的蛋白激酶(Thr202/Tyr204) 抗体都是通过细胞信号技术得到的。对抗细胞色素C的单克隆抗体（7H8.2C12）是购自BD Pharmingen公司，人类白血病HL-60癌症细胞是由日本癌症资源中心提供，茵陈蒿的花朵购自日本从田的Wakanyaku有限公司。HL-60细胞在无血清细胞冻存培养基中培养，添加10％通过加热灭活的胎牛血清，在5％CO2与37℃条件下培养。细胞培养的浓度维持在每毫升含2-3times;10^5个细胞，并且每2 - 3天进行观察使细胞呈对数增长，正常的人胚胎肺成纤维细胞是从美国标准菌库获得的，添加10％通过加热灭活的胎牛血清后，相同条件下在中等培养基(表达载体)中培养。

茵陈二炔酮与茵陈二炔的分离

将茵陈蒿花(100g)放置在一个1升的硬质长颈烧瓶中，加入500毫升的水，后面连接一个计量的精油回流冷凝器，加热温度控制在130°C到150°C之间，将烧瓶中的物质加热至沸腾，正如日本药典的精油部分的内容所述，精油溶解于二甲苯(2ml)。将二甲苯蒸发后，将挥发油（300mg）溶液加到高效液相色谱中(十八烷基硅烷键合硅胶,乙腈-水（17:3)来分离茵陈二炔酮（保留时间：8.0min，85mg）和茵陈二炔（保留时间：8.6min，21mg）。

茵陈色原酮与6 ，7-二甲氧基香豆素的分离

商用的茵陈蒿花(100克)通过柱状的XAD-II型离子交换树脂(水→甲醇)后得到甲醇提取液部分(6.5 g)。 甲醇提取液部分经过 LH-20型葡聚糖凝胶(甲醇)色谱法得到三个部分(B-1到B-3)。其中 B - 2(2.5 g)部分经过多次硅胶柱层析法(三氯甲烷-甲醇-水(19:1)n-己烷-乙酸乙酯(7:3)]后得到茵陈色原酮(5,7-二羟基-2 -(4-羟基苯氧基)-6-甲氧基-4H-苯并吡喃-酮-4-1)(41 mg)和6,7-二甲氧基香豆素(6，7-二甲氧基-2H-苯并吡喃-酮-2-1)(530毫克)。

6茵陈二炔酮纯度的鉴定与评估

茵陈二炔酮的鉴定以及对其纯度的评估是通过对NMR谱数据进行分析得到的。核磁共振氢谱(600MHz,CDCl3)和核磁共振碳谱(150 MHz,CDCl3)组成傅立叶转换核磁共振系统。1H NMR delta;:8.12(2 H,m，H-2,6),7.49(2 H,m H-3,5),7.62(1 H,m,H-4),2.09(3 H,S - 6)。13C NMR delta;:177.2(C-1),136.6,134.4,129.6,(C-1-C-6),86.5,78.5,70.8,63.4(C-2-C-5),4.93(C-6)。

细胞凋亡的分析

通过观察用Hoechst33342染色过的细胞的细胞核形态来判定细胞凋亡，加入10mu;M的 Hoechst33342在4℃下对细胞染色15分钟后，在荧光显微镜下观察。对DNA碎片的分析是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，操作如下：将用药物处理过或未经处理的细胞通过离心收集，并且用Dulbecco磷酸盐缓冲溶液（无二氧化碳和镁离子）润洗。润洗后的细胞悬浮于含有0.1％核糖核酸酶A的裂解缓冲液中（10mM三异丙基乙磺酰-盐酸（pH8.0），10mM EDTA，0.5％SDS）,并在50℃下温育60分钟。将裂解物放入1mg/ml的蛋白酶K中，在50℃下继续温育60分钟，将最终所制备得到的DNA放入三羟甲基氨基甲烷醋酸缓冲液（40mM的Tris乙酸盐，1mM EDTA）中，通过凝胶电泳进行分析。电泳后，用溴化乙锭染色剂来使DNA显色。

甲基四氮盐的鉴定

用样品化合物处理细胞的悬浮液。在37℃下培养3天之后，加入2,3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基] -2H-四唑鎓-5-碳酰苯胺（XTT）和吩嗪硫酸甲酯（PMS）的混合物，将细胞继续培养4小时后，用96孔板酶标仪在在540nm下测定吸光度。

细胞裂解物的制备

细胞用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次后，细胞在缓冲液（10mM

Tris-盐酸（pH7.4），1mM EDTA，1mM EGTA，5mu;g/ml抑肽酶，5mu;g/ml亮肽素，5mu;g/ml的抑肽素A，5mu;g/ml抗蛋白酶，50mM氟化钠，2mM原钒酸钠，10mM焦磷酸钠，0.15M氯化钠，1% TritonX-100，0.5mM 1％苯甲磺酰氟）中裂解。将裂解物在15000times;g的离心力下离心15分钟，并且对上清液进行免疫印迹分析。

免疫印迹分析与蛋白激酶活性测定

用SDS-PAGE将细胞裂解物分离，得到30mu;g蛋白质，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。首先用TBST（20mM Tris-盐酸（pH7.4），0.15M NaCl，0.05％吐温20）漂洗该膜，用加入了5％（重量/体积）脱脂牛奶的缓冲液在室温下阻断1小时。 随后封闭的阻塞膜放在稀释至1：200至1:1000的缓冲液的第一抗体阻断区中，在室温下探测1小时。用TBST将膜洗涤三次后，用与小鼠免疫球蛋白共轭的过氧化物酶抗体或与兔免疫球蛋白共轭的过氧化物酶抗体在室温下温育1小时。用TBST将膜洗涤后，膜上的蛋白质用ECL蛋白质印迹检测试剂盒（珀金埃尔默生命科学公司，波士顿，马萨诸塞州）进行可视化检测。蛋白激酶的活性和表达可分别通过有特异性抗磷酸化ERK，抗ERK，抗磷酸化JNK和抗JNK的抗体蛋白免疫印记实验来确定。

细胞色素c释放的分析

细胞（1times;10^6）用冰冷的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水洗涤，并使其悬浮于100mu;L冰冷的毛地黄皂苷裂解缓冲液中（磷酸盐缓冲盐水中含0.02％毛地黄皂苷）。冷浴5分钟后，将细胞在10,000times;g的离心力下离心5分钟，并且将上清液进行特定的细胞色素c抗体的蛋白印迹实验分析。

结果

茵陈二炔酮的分离与纯化

我们提取发现茵陈花的精油对人白血病HL-60细胞产生强抗肿瘤活性。为了得到茵陈花中诱导细胞凋亡的有效成分，将主要的精油部分和水提取物分离开。精油部分通过HPLC得到茵陈二炔酮（图1A）和茵陈二炔（图1B），分别在“试剂与方法”部分描述。将水提取液通过 XAD-Ⅱ柱状离子交换树脂，得到水和甲醇洗脱馏分。甲醇洗脱部分进行交联葡聚糖LH-20和反复硅胶柱色谱法进行色谱法分析，得到茵陈色原酮（图1C）和6 ，7-二甲氧基香豆素（图1D）。我们通过比较纯化的化合物与以前报道的NMR谱（图2A和2B）确定茵陈二炔酮。

精油的抗肿瘤活性作用

精油已被报道有各种各样的药理活性，其中包括抗肿瘤活性。图3表明出从茵陈花朵中提取的挥发油对人白血病HL-60细胞生存力的影响。从图中明显看出，加入精油部分治疗后细胞存活率降低。浓度为3.9plusmn;0.6微克/毫升时（表1），细胞活力下降到50％（IC 50）。为了评估参与抗肿瘤活性诱导的化合物，我们对精油中分离出的两种化合物对细胞活力的影响进行了研究。半抑制浓度6.5plusmn;2.9mu;M时，茵陈二炔酮表现出强大的抗肿瘤活性（表1）。茵陈二炔酮的这种生长抑制作用比另一种精油部分茵陈二炔强的多（图3）。我们还检查了茵陈花的水提取液部分对细胞活力的影响。这些化合物中，茵陈色原酮比6,7- 二甲氧基香豆素更有效地减少细胞存活率。 茵陈二炔，茵陈色原酮，和6,7-二甲氧基香豆素的半抑制浓度值分别为134.9plusmn;16.4mu;M，49.3plusmn;12.2mu;M和197.4plusmn;17.5mu;M，茵陈二炔酮的活性分别为21倍，7.6倍，30倍。在茵陈二炔酮和茵陈二炔之间的抗肿瘤活性差异可能是由于茵陈二炔酮中羰基的存在。

茵陈二炔酮诱导细胞凋亡归纳

正如凋亡的形态学改变术语最初所定义，即细胞体积减少，细胞核中的染色质缩合，DNA片段上的染色质被分解为约180bp的倍数。为了确定由茵陈二炔酮诱导的细胞死亡是由于细胞凋亡或细胞坏死，对茵陈二炔酮诱导形态变化进行研究。图4表明已经用1mu;茵陈二炔酮处理6小时的HL-60细胞的形态变化。细胞出现明显的凋亡的现象，包括染色质凝聚和核碎裂（图4C和4D）。与此相反，未处理的对照细胞没有明显的形态学变化（图4A和4B）。图4E和4F显示在HL-60细胞中茵陈二炔酮对细胞凋亡形态学变化的诱导的影响。从图中可以明显看出，在相同的实验条件下（图4E和4F）几乎没有产生形态学变化。对DNA片段进行分析，这被认为是细胞凋亡的早期事件。已用0-5mu;茵陈二炔酮处理8小时的HL-60细胞经过琼脂糖凝胶电泳，观察到有典型阶梯型的核苷体间DNA片段（图5A，左图）。然而，在5mu;M的浓度时DNA片段化程度较高，这表明可能会有一些细胞内信号阻止更高浓度茵陈二炔酮导致的凋亡。当细胞用2mu;茵陈二炔酮治疗时，开始治疗后的4小时内能明显的看到DNA碎片（图5A，右图）。与此相反，在相同的实验条件下，茵陈二炔对DNA片段诱导几乎没有影响（图5B）。图5C显示出了在WI-38正常人成纤维细胞中茵陈二炔酮对DNA片段化的诱导的影响。与HL-60细胞相比，用茵陈二炔酮治疗WI-38细胞时，没有诱导DNA片段化。这些结果表明，茵陈二炔酮能有效的使人类白血病HL-60细

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