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可精确控制载药量的pH敏感性聚乳酸-阿霉素纳米粒子制备

摘要

具有高载药量和PH响应性的纳米颗粒可由疏水性的聚合物-药物偶联物（PDC）的纳米沉淀制备而成。本文中的PDC即PLA-g-DOX的合成是先通过叠氮化物-炔点击反应合成将含乙炔功能团的PLA转化成PLA-G-ALD，随后与DOX缀合，从而在药物部分与聚合物支架之间形成对酸敏感的席夫碱键。在PLA-G-DOX PDC中，用核磁共振氢谱和紫外可见光谱测得DOX的负载量为32％（重量）。通过在聚乙二醇表面活性剂中形成纳米沉淀，将PLA-G-DOX PDC进一步制备成可精确控制药物负载量的纳米粒。并对有机溶剂的影响，PLA-G- DOX PDC浓度，以及在尺寸上PLA-G-DOX /表面活性剂的质量比和纳米颗粒的尺寸分布做动态光散射（DLS）和透射电子显微镜分析（TEM）的系统审查 。在最佳条件下制备的纳米颗粒表现出良好的球形形态，其体积平均流体动力学直径（DH）约100纳米。由于PLA-G-DOX PDC 中存在席夫碱偶联键合作用，可观察到纳米颗粒的酸敏感的药物释放行为。抗MCF-7乳腺癌细胞的体外研究表明，该纳米颗粒易吸收并提高了DOX·HCl的治疗效益，这表明其在抗癌纳米医学应用上很有前景。

前言

随着对给药机制和癌症病理了解的深入发展，一系列指导癌症治疗给药系统的制备的标准逐步建立。给药系统必须无长期严重的毒副作用，因此，具有生物相容性和生物可降解性的材料在给药系统的制备中得到广泛使用。为了有效地杀灭癌细胞，抑制肿瘤细胞增殖，载药量需足以产生显著的治疗效果。优选肿瘤细胞中刺激性反应药物释放的给药系统，来尽量减少药物毒性，改善药物传递速率。具体来说，因为肿瘤组织的酸性是略高于正常组织的，所以近年来具备酸触发药物释放行为的DDS引起人们广泛的兴趣。此外，通过增强渗透性和保留（EPR）效果，10-100纳米的纳米级的尺寸可避免药物在全身的快速清除，具备肿瘤被动靶向性，可能是DDS的最佳选择。肿瘤靶向配体和显像剂掺入到DDS中可以进一步产生主动肿瘤靶向和DDS中的生物分布的相对可视化。此外，在DDS的结构设计时，其他的因素如稳定性和支架的尺寸均匀性也应考虑在内并加以优化。为了实现更好的癌症治疗效果，能够尽可能满足以上标准的DDS是各种研究所一直积极追求的。

作为具有生物相容性和可降解特性的聚合物中的主要一类聚合物，脂肪族聚酯如PLA,PLGA,PCL等，在制备纳米给药系统中一直得到广泛的应用。在大多数研究中，基于脂肪族聚酯的给药系统制备是通过自组装方法将药物装填入纳米粒子的疏水内核中。例如，通过水不溶性的聚合物在包含药物的溶液中自组装，纳米沉淀很容易形成药物填充式的聚合物型纳米粒.虽然通过典型组装方法完成填充过程是比较容易的，但仍可能受到一些条件限制。一般来说，只有与聚合物结构支架相似的几种含量的药物才能被填充进去，同时在给药系统的给药中，必须要达到相应较高的聚合物浓度。而药物装载量不能提前预估且可能出现批量差异。因为药物是通过填充的给药系统的分解释放的，通常可以观察到在开始的几小时内快速药物释放的突发性效果，其可能导致全身性毒性作用。

为了增加药物载量，抑制给药系统的突发性影响，聚合物与药物形成的偶联物（PDCs）的制备，包括这些正被应用的脂肪族聚酯式的支架已经愈发引起人们的研究兴趣。典型的后聚合功能化方法被已运用到带终端药物部分的PDCs的制备中。根据陈和相关研究人员表示，药物引发的丙交酯的聚合也被发展到在PLAs的alpha;端键合药物，且纳米沉淀方法之后也被运用到将PDCs转化成NP传递装置中。为进一步提高药物装载量，多价脂肪族聚酯应该被用来做聚合物支架。通过联合聚合方法由几种基团的作用可制备带有许多羟基的功能性PLAs.Kolishetti et al.进一步利用羟基功能化的PLA来键合成顺铂类的前药。京及其同事也合成了一种可生物降解的两亲性嵌段共聚物，这种共聚物有一种羟基功能化的脂肪聚酯空穴，能进一步与阿霉素（dox)键合。但这些羟基功能化的多样可生物降解的支架的制备过程相对比较冗长，因为制备这些支架常需要使用被保护的单体，在聚合反应后又要去保护。

我们团队曾用功能性丙交酯制备炔基和烯丙基功能性的PLAs,没有去保护工序，然后通过高效叠的氮化物-炔或硫醇-烯点击反应进一步将其转化成新颖的应用于药物或基因递送的基于PLA的缀合物和纳米结构。具体而言，在我们先前的报道中，我们合成了具有用于携带聚（乙二醇）的PLA型骨架和紫杉醇（PTXL）药物部分的刷聚合物-药物缀合物（BPDCs），并对他们的性质特别是药物释放行为进行了研究。在此，我们提出了关于DOX-PLAg-纳米颗粒的我们的最新研究，这种纳米颗粒可实现精确控制的高载药量和PH引发释放。这项工作与一些重要的设计想法合为一体。首先，DOX作为最常用的化疗剂之一，被选为与生物可降解的PLA基骨架缀合的模型药物。其次，由于DOX具有反应活性的氨基官能团，可设计出敏感性的席夫碱偶联键将DOX与PLA-G- ALD的醛官能连结，以达到PH-引发DOX释放的效果。因此，PLA-G-ALD需要通过官能团转换由炔官能化聚乳酸合成。第三，为实现具有高含量键合DOX的纳米颗粒,需要准备疏水PLA-G-DOX PDC，然后通过纳米沉淀过程将其转换成水分散性纳米粒子。第四，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N- [马来酰亚胺PEG-2000]（DSPE-PEG2k-MAL）是一种生物相容的表面活性剂，被选为纳米沉淀中的表面活性剂。其结果是，该纳米颗粒的基于PEG的电晕可以显着提高纳米颗粒的稳定性和循环时间，且通过硫醇 - 马来酰亚胺反应，可进一步利用PEG链的马来酰亚胺端基来引入靶向肽。

实验部分

材料：6-溴-1-己醇（97％），4-二甲氨基吡啶（DMAP;gt; 99％），和N，N-二环己基（DCC; 99％），以上化学试剂都从Sigma-Aldrich公司购入。叠氮化钠（99％），三乙胺（TEA;gt; 99％），五水硫酸铜（硫酸铜·5H2O；gt;98%），抗坏血酸钠（NaAsc; 99％），二氯甲烷（DCM; HPLC），四氢呋喃（THF; HPLC），乙酸乙酯（HPLC），己烷（HPLC），N，N-二甲基甲酰胺（DMF; HPLC），和DMSO（HPLC ）分别购自Fisher Scientific公司。阿霉素盐酸盐（DOX·HCl的;gt; 99％）从LC实验室（马萨诸塞州沃本）购得。 DSPE-PEG2k-MAL从创意PEGWorks（温斯顿 - 塞勒姆，NC）购得。

仪器：1 H NMR谱是Varian INOVA NMR波谱仪在室温500兆赫下测得的，将该样品溶解在CDCl 3中(原子Dgt;99.8％),其中含有体积容积为1.0％的四甲基硅烷（TMS）或甲基亚砜-D6（DMSO- d₆，原子Dgt; 99.5％）。通过使用提供双极脉冲对激回波卖主Dbppste ）脉冲序列，可获取室温500兆赫下的Varian INOVA NMR波谱仪上PLA-G-DOX和DMSO-d6中游离DOX的质子2D扩散有序光谱（DOSY）数据。在使用120 ms的扩散延迟和2.0毫秒的扩散梯度长度下，梯度是从2.843至70.85高斯/厘米（15级）非线性地变化; 每个15递增梯度值具有一到二的弛豫延迟，收集64瞬变。使用供应商提供的软件程序VNMRj（3.2版本）中的数据进行分析。通过使用衰减全反射（ATR）采样附件，布鲁克张量27系统上获得了FT-IR光谱。用波长范围在300至800纳米的Shimadzu UV-3600分光计测得其紫外可见吸收光谱。用VG 70-SE质谱仪在电子电离模式下记录高分辨率质谱（HRMS）的数据。用配备有一个VE-3580的折射指数（RI）检测器，一个检测在波长490nm的VE-3210 紫外可见分光光度计和一个VE 1122泵及两个混合床有机列（PAS-103M和PAS-105M聚苯乙烯MW排阻限分别高达70times;103和4times;106）的Viscotek GPC系统测得GPC数据。DMF（HPLC）和0.01M LiBr混合用作聚合物溶剂和GPC的洗脱液，流速为55或65℃的0.5毫升/分钟。该GPC仪器从瓦里安购得，用10单位窄分散的线性聚苯乙烯标准（最大峰值兆瓦（MP）= 0.58，1.53，3.95，10.21，29.51，72.45，205，467，1319和2851 kDa）校正.在25度的水浴下用纳米ZS90仪器（马尔文公司）的DLS可测得DH和纳米颗粒的zeta;电位值。所有实验均使用4毫瓦633纳米的氦氖激光作为入射激光束的光源，在90°的固定测角进行测量。用累积量方法结合Mie理论来分析出相关衰减函数，从而获得体积和数量分布。

使用JEOL 2010显微镜获得透射电子显微镜（透射电子显微镜）图像。透射电镜样品的制备是先滴加10mu;l纳米粒子水溶液（0.05毫克/毫升）在一个碳包覆的铜网格，然后用10mu;L 0.5%醋酸双氧铀溶液负染。

使用配有405、442、458、476，496，488，543，和633纳米的激发激光线，能够在400minus;720 nm范围进行特殊探测的徕卡tcs-sp2 / AOBS共聚焦显微镜获得细胞成像。所有的共聚焦图像都是在相同条件下（光电探测器增益，针孔大小的参数，和曝光时间保持不变）获得。

合成6 -叠氮基- 1 -己醇（1) 室温下在100毫升瓶中，将6 -溴- 1 -己醇（1.39克，7.69毫摩尔）溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中，然后慢慢加入 NaN3 (1.00 g, 15.4 mmol)，搅拌反应3天后，将DCM（50毫升）加入到反应混合物中，再用纯化水（3个30毫升）和盐水（30毫升）萃取。收集有机层用Na2SO4干燥，一单位反应物得1g的6 -叠氮基- 1 -己醇，为微黄色油状物（产量：91%），核磁共振氢谱(500 MHz,CDCl3, ppm)结果为 : delta; 3.64 (t, 2H, J = 6.0 Hz, CH2OH), 3.27 (t, 2H, J = 7.0Hz, N3CH2), 1.67minus;1.38 (m, 8H, N3CH2(CH2)4CH2OH)。FT-IR(cmminus;1)结果为: 3345, 2935, 2861, 2092, 1668, 1456, 1412, 1387, 1350, 1258,1158, 1056, 894, 805, 729, 663

合成6-叠氮己基-4-甲酰苯甲酸(2) 在一个250毫升烧瓶中，将制得的产物(1）（0.90g,6.3mmol)，4-羧基苯甲醛（1克，6.61mmol)、DMAP（0.154g，1.26mmol）在氮气保护下分别溶解在70毫升无水四氢呋喃中。然后加入DCC(1.95g,9.45mmol)，室温下搅拌反应24 后，将反应物过滤除去滤渣，然后再用柱色谱，以己烷：乙酸乙酯=9:1至7：3为展开剂洗脱分离，获得1.33g油状无色的产物(2)1.33g(产率70%）。核磁共振（500MHZ，CDCl₃，PPM）：delta;10.11（s ，1H，C₆H₄CHO），8.20和7.96（m ，4h，C₆H₄CHO）、4.37（t，2H，J = 7HZ，CH2CH2OCO）、3.29（t，2H，J= 7赫兹，N₃CH₂），1.84minus;1.46（m，8H，N₃CH₂（CH₂）₄）。红外光谱（cm^-1）：2861，2938，2734，2094，1610，1578，1504，1464，1419，1385，1705，1272，1350，1201，1168，1016，963，855，816，759，732，688，631，1104。

高分辨率质谱：[M Na] 调用C₁₄H₁₇O₃N₃，结果为298.1166，298.1162；

合成PLA-g-ALD(4) 正如在我们之前发表的研究中所描述，炔基化丙交酯单体和丙交酯开环共聚可得到炔基化的PLA（3；Mn^NMR= 9.3 kDa，Mw /Mn^GPC = 1.23；有54mol%的炔基与骨干重复单元相似）。在氮气保护下，向10ml安瓿瓶中加入反应物3（100mg，0.34mmol的炔基），反应物2（94mg，0.34mmol），CuSO4·5H2O （4.3mg，0.017mmol）和 NaAsc（8.1mg，0.041mmol），接着再加入充溢了氮气的DMF（4ml）.室温下搅拌反应24h后，反应混合物用50ml的DCM稀释，然后用去离子水萃取三次，再用盐水萃取两次，接着用丙酮透析（MWCO：3.5minus;5 kDa）3天。最终得,157mg的无色聚合物4(产率81%）。核磁共振氢谱（500MHz，CDCl3，ppm）：delta;10.10（S，1H来自化合物 2，C6H4CHO），8.17.和7.95（m，4H来自化合物 2，C6H4CHO）、7.50（s，1H来自唑，Cchn3），5.40和5.16（Br m，2H来自ochcoo3，的单体），4.33（s，4H 来自化合物2，NCH2（CH2）4CH2OCO），3.20minus;3.40（Br，m,2H来自化合物3的炔烃化单元单体，CHCH2），1.92minus;1.38（Br,m ,8H来自化合物2，NCH2（CH2）4CH2；所有的CH3来自化合物3）

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