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香青兰毛状根的迷迭香酸含量和抗氧化能力

Izabela Weremczuk-Jezyna . Izabela Grzegorczyk-Karolak.Barbara Frydrych . Aleksandra Kroacute;licka ^bull;Halina Wilkinsonacute;ska

收稿日期：2012年7月6 /修订日期：2013年2月15日/接受日期：2013年2月19日/在线发表时间：2013年3月17日。这篇文章开放发表在获取（S）Springerlink.com。

摘要：香青兰毛状根为用发根农杆菌A4菌株诱导，从高达3％的低转化率的拍摄外植体获得的转型根。Murashige和Skoog（MS），Gamborg等人对不同的液体介质的影响下 （B5）和木本植物（WP）与全半强度（-MS，-B5，-可湿性粉剂），干物质积累和迷迭香酸（RA）的含量进行了调查。毛状根在均光照（16小时光照/ 8小时黑暗）和黑暗下培养。青兰属毛状根生物量是根据周期性光WP培养基中生长的最高（7.23克szlig;ask-1鲜重，干重的0.89克szlig;ask-1）。超高效液相色谱分析表明，在光照条件下-B5培养基培养根最高RA含量（78毫克G-1干重）。它相比同等生长的母株根部大约高10倍。对其抗氧化活性，并在光照和黑暗环境长的香青兰植物根部在B5和WP培养基上培养毛状根的甲醇提取物中总酚含量进行了比较。使用1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）自由基活性清除和磷钼减少试验对所有的提取物进行了研究，总酚含量由FolinETH; Ciocalteu 法估计。香青兰毛状根生长在B5培养基下的甲醇提取物具有较强的光EST的影响减少钼和DPPH自由基清除。活动意义明显升高（P 0.05）比那些根在THORN;坡种植完整的植物萃取物。最活跃的毛状根的甲醇提取物的迷迭香酸和酚类化合物的总含量的最高水平。

关键词：毛状根、农杆菌、迷迭香酸、抗氧化活性

简介

香青兰属，在伊朗俗称Ocirc;Ocirc;badarshooOtilde;Otilde;，属于唇形科一年生芳香植物。这种植物原产于西伯利亚和中亚，欧洲东部和中部也已经有种植。 香青兰经常被用来作为食品成分添加剂和补充剂，以及用于胃和肝脏疾病的治疗，和头痛（Dastmalchi等人2007a，b）。也有报道其有抗幽门螺杆菌活性（Ghanndi等，2004），以及镇静，镇痛和龙头提取物的伤口愈合性能（苏丹等，2008）。香青兰的地上部分的粗提取物包含一些成分充分证明的生物活性，包括黄酮类（木犀草素，7-O-葡萄糖苷木犀草素，芹菜素），环烯醚萜，挥发油成分，齐墩果酸以及羟基羧酸与咖啡酸，阿魏酸和迷迭香酸（Kakasy等人2006;Popova 等人2008;苏丹等，2008）。

迷迭香酸（RA）是咖啡酸和3,4-二丹参素的酯。由于其抗氧化、抗菌抗炎作用，RA被作为一种预防的食品和药物，（Bais等人2002; Ly等人，2006; Park等人，2008）。有报道关于RA对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）（Sanchez- Medina等人，2007），人免疫缺陷病毒（HIV-1）（Tewtrakul等，2003）和幽门螺旋杆菌（春等。 ）的作用。考虑用于药物，化妆品和食品工业的化合物的重要性，对野生生长的植物进行了大量调查，并从细胞，愈伤组织和器官培养（Janicsa`k1999年等人获得的RA; Bauer等人2004; 。Georgiev的等，2006;公园等，2008）获得了RA。基于体外生物技术方法的植物培养物被认为是提供一种生产源化材料的独立的环境因素准则性的可能性。

尽管RA已经能从香青兰植物中萃取（Povilaityte等2001），但此种相对于体外酚类化合物的生产没有任何信息。目前这个研究是主要调查香青兰的毛状根培养生产RA的。这些根的植物组织被土壤细菌感染后获得了比其他的体外培养系统更好的特征AST、生长素独立生长、次生代谢产物高层次和更好的遗传和生化稳定性相（Giri和narasu 2000）和Narasu 2000）cterized。在这里，我们描述了建立D. moldavica毛状根培养。据我们所知，这是在此植物物种的遗传转化的第一份报告。该毛状根培养通过监测媒体的COM位置和物理条件的影响（暗光及光含量）增长和RA的内容进行了优化，相比于香青兰的完整植物根，RA的含量在毛状根不断增长 。从改造自然和甲根提取物抗氧化活性的比较分析，还介绍。为此，使用两种测定方法（DPPH清除自由基的活性和磷钼络合还原过渡金属离子）。确定在毛状根和完整植物的根甲醇提取物总phe- nolic物质含量寻找抗氧化性能的相关性。

材料和方法

植物材料和细菌菌株

香青兰的种子是从卢布林的植物园（波兰）购买的。种子用2分钟2％的次氯酸钠溶液进行表面灭菌。用无菌蒸馏水漂洗后，将种子在26℃下置于琼脂（0.7％）0.02毫克的L-1激动素和1.0mg L-1的赤霉酸的培养基，在黑暗中发芽MS（MS (Murashige and

Skoog 1962) 。发芽后，将幼苗转移到光条件下（16小时光照/ 8小时黑暗;低温荧光灯;40 LM M-2 S-1）。茎尖（长0.3-0.5厘米）从4周龄幼苗切下放置在MS琼脂med-含有0.1mg鎓L-1的吲哚-3-乙酸 - 乙酸（IAA）和0.2毫克L-1苄氨基嘌呤（BAP）的培养基中检测。 4周后，将多芽转移到没有生长调节剂的MS培养基，而不调节生长。

发根农杆菌A4菌株农业松型质粒PRI A4被种植在黑暗YMB中，在26℃琼脂培养基（Vervliet等1975）放置48h用于转化。

诱导和毛状根培养

将四周龄无菌芽（2厘米长）和叶（0.5厘米）从枝条切除作为外植体用于农杆菌介导的转化。外植体用消毒针头沉浸在BAC中刺入。芽在茎节，叶子在叶柄结束最靠近叶片接种。控制外植体（芽和叶），用消毒针头相同地方创刺入。 80-100每两个类型的外植体接种和实验重复3次。接种后的控制外植体在26℃MS琼脂培养基上培育，而不在黑暗中温育。 3周后，将被感染的芽的受伤部位所形成的根被切断并分别转移到含有30毫升半强度B5液体培养基（Viacute;B5）（Gamborg等人，1968），用氨苄青霉素100毫升（500毫克L-1）消除细菌。将培养物置于100rpm旋转振荡器保持在黑暗中。第五次培养（每1周）后，氨苄青霉素的浓度降低至250毫克的L-1。连续5代后，氨苄青霉素从培养基除去并且获得无菌根培养物。这表明毛状根线在Viacute;B5液体培养基中充分生长，被选作进一步调查。

PCR分析

采用由Bekesiova等人描述的方法对D.香青兰毛状根和未转化的DNA根进行分离 （1999年）。 用特异引物进行聚合酶链反应。用于放大rolB基因引物序列：50-GCT CTT GCA GTG GAT CTA TT-30;50-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-30和rolC的基因50-CTC CTG ACA TCA AAC TCG TC-30; 50 TGC TTCGAG TTA TGG GTA CA-30。每个PCR含有标准的PCR缓冲液（Promega公司，麦迪逊），2毫克氯化镁，0.210mM的dNTP（Gibco BRL公司），8摩尔各引物和75-100纳克目标DNA（最终体积50 L）的。扩增条件如下：35个周期，初始变性条件为94℃3分钟，然后在94℃变性1分钟，在53.5℃退火（1分钟），在72℃伸长（1分钟），然后进行最终伸长6分钟。扩增的序列进行电泳在TBE缓冲液的1.2％琼脂糖凝胶上分离。将凝胶用溴化乙锭染色并在紫外光下观察。为了确认被检查毛状根是真正转化PCR使用virG基因（Ri质粒的T-DNA基因转移以外）进行的。引物扩增virG基因序列分别为50-ACT GAA TAT CAG GCA ACG CC-30和50 GCGTCA AAG AAA TAG CCA GC-30。扩增条件在virG基因的情况下，系统蒸发散如下：35个周期，初始变性条件为94℃3分钟，然后在94℃变性1分钟，在53.5℃退火（1分钟），在72℃伸长（1分钟），然后进行最终伸长6分钟。扩增的片段通过电泳在TBE缓冲液的1.2％琼脂糖凝胶上分离。将凝胶用溴化乙锭染色并在紫外光下观察。

生长培养基的优化

培育十代后，毛状根（0.2–0.3 g鲜重）被转移到含有80毫升的液体介质的300毫升锥形瓶中：MS，WP（Lloyd and Mc Cown 1981）或B5全和半强度宏观和微观的盐浓度。所有媒介包含3%蔗糖。媒介的PH值调整为5.6至5.9。，在1.06公斤的压力下121 ℃在高压釜中17分钟将媒介进行消毒。在保持黑暗中或在一个周期（16 h、8 h光/暗）与光照强度40 LM m-2 s-1，在100 rpm的旋转振动筛中培养。每5周进行一次。然后，收获的毛状根，测量新鲜和干燥的毛状根重量。三瓶用于各种介质的类型和培养条件（光/暗度）的D实验进行了三次。鲜、干重均表示为毫克每瓶。

体内源的根

从相同的种子衍生的体外培养，培养6个月的药学在罗兹医科大学部的试验田香青兰植物收获，用水清洗后用于RA的提取。根的形成和转化为D在非RA香青兰根的含量比较。

RA的提取

在室温下，使用超声波浴，用70％的MeOH（25毫升）萃取（Janicsa`k等，1999）

冻干和粉状植物材料（150毫克）（35日龄转化根和外地生长6个月大的完整植物的根）3次10分钟。过滤后，将萃取物合并，并减压蒸发至干。将残余物溶解在甲醇（10mL）中。 1毫升甲醇提取物的混合物岑trifuged以18000rpm3分钟。取上清液用超高效液相色谱（UPLC）分析。

RA的超高效液相色谱分析

采用装有光电二极管阵列，UV-可见光检测器和一个autoin-投影机和超性能液相色谱仪（Waters），根据Lamien-美达等人描述的方法进行分析。在协作上的盾构反相C18柱（2.1 9 100毫米，1.7流明孔径）进行分离UMN温度35℃的。在这项研究中，所用的溶剂梯度由溶剂A（乙腈85:15体积/体积的1％乙酸）和溶剂B（甲醇）组成的。下面梯度系统用于：0-14.6分90％的溶剂A; 14.6-16.6分钟100％溶剂B，16.6-17min ,90％溶剂B，流速为0.43ml/min。在360nm处进行检测。RA的鉴定通过与标准化合物进行比较其滞留时间完成。正品RA（ChromaDexTM）保留时间为3.8分钟。 RA浓度估计交配由超过5-200 LG毫升-1的范围内的正品化合物构造有校准曲线的峰面积的校准曲线的线性由相关系数（R 2 = 0.9994）验证。用于从毛状根培养物和未转化的根生产的RA实验以三个重复为每个介质和培养条件（光周期或暗度）重复三次。所分析的样品中的RA含量表示为每克干重的毫克。

液相色谱-质谱法（LC）

LC-MS/ MS使用了API的LC / MS / MS系统（Applera公司，美国）和装有戴安（德国）HPLC系统电喷雾电离（ESI）源。高效液相色谱参数如上所述。在执行都符合条件设置如下负离子模式检测：干燥气体（N2）11.0大号分钟-1，温度350摄氏度，硝基 - 根雾化器压力40磅，毛细管电压4.5千瓦，1600伏的检测器增益，碎裂电压90 V和全扫描范围为100〜900 M / Z。

抗氧化试验

提取物的制备

用70%甲醇分别提取（150毫升）冻干粉末和植物材料（1克）。提取过程是相同的如上所述。

总酚含量

总酚含量采用singlenton（1965）等人描述的基于比色法的福林试剂计量估计方法。400个将每个提取物被添加到测试管共同含2毫升的福林–ciocalteu试剂和1.6毫升7.5%碳酸钠。在室温下孵育30分钟后在765nm的吸光度测量。量化被相对于没食子酸的标准校正曲线进行。结果表示为每克干提取物的没食子酸毫克当量（GAE）。

磷钼还原

采用Prieto等的方法 （1999）测定香青兰根提取物的还原力。 在蒸馏水中，每0.4毫升各提取物的测试（100 LG毫升-1）与试剂溶液（1.2毫升）含钼酸铵（12毫米），磷酸钠（84毫摩尔）和硫酸混合（1.8 M）。TURE管子与反应混合，在水浴摇床90℃孵育90分钟。在室温下冷却后，将含0.4毫升甲醇与1.2毫升试剂溶液混合，将绿磷钼络合物的吸光度（分光光度计北京瑞利，公司中国）空白695处测定。提取物的还原能力使用下式计算：ABS最后=绝对样品 - ABS空白 - 绝对提取物。选用丁基化羟基甲苯（BHT）和生育酚标准。结果表示为每克干提取物的抗坏血酸当量。该测定法采取一式三份进行。

DPPH自由基清除

采用Brand-William（1995年）描述的方法s等人测定1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）自由基活性。将不同浓度的甲醇提取物（2.0，20.0，100.0，200.0，500.0和000.0 LG毫升-1）与同体积的合0.2mM的DPPH的甲醇溶液（自Sigma-Aldrich）混合。 在室温下孵育30分钟后，记录用UV/可见分光光度计在517 nm处检测的吸光度。清除自由基的能力按下式计算：％清除= 100 - （绝对样张 - ABS控制）/ ABS DPPH9100％，其中绝对样品是未经DPPH样品的吸光度。 BHT和alpha;-生育酚溶液用作标准。与会者表示抗自由基的EC50定义为一个样品（LG毫升-1）的浓度在该50％的最高清除活性被记录下来。该测定法采取一式三份进行。

统计分析

所有结果均为平均值的标准差。这意味着测试由曼–Mann-Whitney U检验在5%水平上差异有统计学意义（StatSoft STATISTICA 5，波兰）。EC50和相关系数（R2）的抗氧

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