依诺肝素钠注射液中硫酸盐测定方法的研究
2022-11-04 10:10:05
论文总字数：17800字
摘 要
肝素是一种酸性黏多糖，主要是从猪小肠粘膜、肝、肺脏等组织细胞中提取，由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生。无论在体内或是体外，肝素的抗凝作用都不可小觑，故肝素作为抗凝剂用于日常的临床手术或作业之中。而低分子肝素则是以未分级的肝素为起始物料，经过进行一系列风险分级管理或者通过降解得到的一类具有分子量更小的抗凝血药物[1]。离子色谱是高效液相色谱的一类分支，近年来在药学领域发展较快。本文主要是针对依诺肝素钠注射液运用离子色谱仪进行硫酸盐杂质的测定的方案的研究。
关键词：离子色谱；依诺肝素钠；质量控制；游离硫酸
Study on the Determination Method of Sulfate in Enoxaparin Sodium Injection
Abstract
Heparin is a kind of acidic mucopolysaccharide, which is mainly extracted from small intestinal mucosa, liver, lung and other tissue cells, and produced by mast cells and basophils. Whether in vivo or in vitro, the anticoagulant effect of heparin can not be underestimated, so heparin as an anticoagulant is used in daily clinical operation or operation. Low molecular weight heparin is a class of anticoagulant drugs with smaller molecular weight, which is obtained from unfractionated heparin as the starting material through a series of risk grading management or degradation. Ion chromatography is a branch of high performance liquid chromatography, which has developed rapidly in the field of pharmacy in recent years. This paper mainly studies the determination of sulfate impurities in enoxaparin sodium injection by ion chromatography.
Key words:Ion Chromatography; Enoxaparin Sodium; Quality Control; Free Sulfate
目录
摘 要 I
Abstract II
第一章 引 言 1
1.1课题研究及意义 1
1.2依诺肝素钠的结构与性质作用 1
1.2.1依诺肝素钠的结构 1
1.2.2依诺肝素钠的性质与作用 1
第二章 硫酸盐测定方法及依据 3
2.1硫酸盐测定方法-离子色谱法 3
2.2药典要求 3
第三章 依诺肝素钠硫酸盐杂质测定 5
3.1测定项目 5
3.2实验仪器 7
3.2.1仪器确认 7
3.2.2试剂和材料 7
3.3试验方法 8
3.3.1色谱条件 8
3.3.2溶液配制 9
3.3.3样品分析 10
3.3.4数据处理 10
3.3.5接受标准 11
第四章 结果与分析 12
4.1系统适用性验证 12
4.2定量限 18
4.3线性 19
4.4专属性 21
4.5重复性 21
4.6准确度 22
4.7中间精密度 23
4.8溶液稳定性 24
4.9耐用性 25
4.10异常情况 26
第五章 结 论 27
谢辞 28
第一章 引 言
1.1课题研究及意义
依诺肝素钠是一种低分子量肝素，是一种临床上用于预防和治疗深静脉血栓或肺栓塞的抗凝血剂，由还没有完全成性的复杂的低聚糖组成，其··结构特点是大多数组分在糖链的非还原端有一个4-依诺吡喃糖醛酸的结构，15%-20%的组分在还原端有1,6酐的结构[1]。因为依诺肝素钠是多组分混合物，结构中有数目不定的重复单位和取代基，依靠现代技术还较难对其进行整体的结构确证，因此，对这类仿制品，比较认可的、可溯性与可行度较高的首选方法，就是通过将仿制品与EP提供的依诺肝素钠权威对照品（标准品）同法进行各类波谱的比较[2]。
药品作为一种特殊的商品，其生产及销售过程都有着极其严格的规定，药品中的质量检验是药品生产中的工作重点，具有非常重要的地位。鉴于近年来我们药品市场上发生的对人们造成伤害事件，对药品进行质量控制的重要性便显得尤为突出。近几年来，随着科技的发展和对药品研究的不断深入，肝素制品已经越来越多的出现在大众视野之中，为此，控制好肝素类制品的质量就变得越发重要。
1.2依诺肝素钠的结构与性质作用
1.2.1依诺肝素钠的结构
依诺肝素钠可以通过肝素钠由化学β-消除法制得，其实质是将肝素季铵盐酯化，使之变成肝素苄基酯，然后使其在碱性条件下裂解。依诺肝素钠分子结构如下图[3]：
图 1.1依诺肝素钠的结构
1.2.2依诺肝素钠的性质与作用
依诺肝素钠作为低分子肝素，与普通肝素相比，低分子肝素生化性质更为稳定，主要体现在其分子量降低后，蛋白结合率也有所降低，分子量分散度也得到了改善，能很大程度上提高其制剂临床应用的稳定性，降低了原本肝素在抗凝不足和出血的概率。
在医学研究和临床应用的过程出，低分子肝素展现出对多种病症的治疗作用。如传统的抗凝血、抗血栓作用，对于治疗各种不稳定的冠脉疾病、缺血性脑中风等有重要的作用；再如有大量的临床应用数据显示，低分子肝素对于肿瘤患者有相当好的积极作用，可以抑制肿瘤生长以及转移；在妇产科中则可以治疗妊娠妇女的易栓性[4]，从而达到保胎的功能，促进滋养细胞增殖分化和胎盘的形成。
依诺肝素钠在临床上则主要用于预防急性期深脉血栓的形成，预防腹部外科、矫形手术；治疗伴有肺栓塞的急性深脉血栓患者以及不伴有PE的急性DVT患者。依诺肝素钠目前是抗凝、康栓治疗的主要药物之一[5]。
第二章 硫酸盐测定方法及依据
2.1硫酸盐测定方法-离子色谱法
离子色谱是用来分离离子型化合物的色谱方法，可以解决气相色谱和高效液相色谱无法分析的一些问题，是利用流动相与固定相中的离子来进行可逆的离子交换，对分析复杂结构的极性有机物额外重要[6]。
离子色谱的分离机理主要是电场相互作用，然后是非离子吸收过程，该过程使用低交换容量的离子交换树脂来分离离子[6。 它具有广泛的应用，包括无机离子混合物和有机化合物的分离。
离子对色谱的主要分离机理是分配和吸附，是分离和分析强极性物质（例如强极性有机酸和强碱）的最佳方法7]。与其他色谱图不同，离子色谱的洗脱液使用酸碱水溶液作为洗脱液[8]。用于分离阴离子和阳离子，常用的有碳酸盐缓冲液，稀酸，碱性溶液等[8]。
低分子量肝素是具有复杂结构，负电荷和酶促解聚的化合物，可用作抗凝剂[9]。市场上有许多低分子量肝素和基因产品，因此，控制肝素的质量变得越来越重要。指纹分析方法可以有效控制低分子量肝素的质量。在分离依诺肝素和那曲肝素时可以用反相离子对色谱和电喷雾电离和质谱来进行分离，已分离出200多种化合物[10]。该方法对于低分子量肝素的指纹分析非常有用。可以使用三丁胺，二丁胺，戊丁胺，乙腈和甲醇作为离子对试剂，并使用反相离子对色谱，电喷雾电离和质谱技术进行低分子量肝素指纹分析分离，这种技术也非常适合于低分子量肝素的分离[11]。
2.2药典要求
《英国药典》是最早收载低分子肝素的药典，从1993年版的1994年增补本开始收载， BP2013年版收载了低分子肝素总则和5种生产工艺的低分子肝素各论( 达肝素钠、依诺肝素钠、那屈肝素钙、帕肝素钠、汀肝素钠) ，总则是对低分子肝素产品的最低要求，比如重均相对分子质量在8000以下，小于8000的级分不少于60% ，抗FⅩa与抗FⅡa活性比不小于1.5等，各论中对不同工艺产品的结构、相对分子质量、活性、杂质有更严格的要求，不同种类的低分子肝素应在满足总论要求的基础上，符合各论项下的规定[12]。
除 5 种工艺的低分子肝素原料标准外，BP2013年版还收载了达肝素钠注射液、依诺肝素钠注射液、汀肝素钠注射液。《美国药典》从2008年第31版第二增补本开始收载依诺肝素钠及其注射液，最新版为2014年的第37版，《日本药典》从2006年第15版开始收载帕肝素钠，最新版为2011年的第16版。
我国低分子肝素产品执行的标准主要是 2005 年新药试行标准转正时建立的国家标准及2005年以后审批的企业注册标准。我国的低分子肝素产品基本达到了BP对LMWH的最低要求，但由于没有按生产工艺对低分子肝素进行分类管理，国内标准与国外药典和原研厂家的标准比较，在结构表征、相对分 子质量与相对分子质量分布、抗FⅩa与抗FⅡa活性、杂质 检查等方面项目设置不全面，限度较宽[13]。向国内低分子肝素生产厂家及进口原研厂家征集了样品与资料，共收到11个厂家的27批原料药，13个厂家的49批注射剂，未生产的企业提供了技术资料。
根据企业申报资料，国产低分子肝素生产工艺主要有3种: 由亚硝酸降解得到的达肝素钠、由亚硝酸降 解后选择性去除大部分相对分子质量小于2000的糖链而获得的那屈肝素钙、对肝素苄基酯衍生物进行碱解聚而获得的依诺肝素钠[14]。在原有国家标准的基础上，针对不同工艺低分子肝素的特点，分别制订质量标准，增加对末端结构的确证、增加工艺杂质及降解杂质检查项、更严格的控制相对分子质量与相对分子质量分布、抗 FⅩa 与抗 FⅡa 活性比等项目限度，全面完善和修订我国低分子肝素国家标准，共拟定了 8 个标准，包括达肝素钠、达肝素钠注射液、注射用达肝素钠、 那屈肝素钠、那屈肝素钠注射液、注射用那屈肝素钙、依诺肝素钠以及依诺肝素钠注射液[8]。
由于低分子肝素质量检测项目多且宽泛，本文章仅就依诺肝素钠中硫酸盐的检测作方案验证，其余项目不做多余赘述。
第三章 依诺肝素钠硫酸盐杂质测定
3.1测定项目
本方法验证旨在验证依诺肝素钠（10000 IU/mL）注射液中含浓度为15mg/mL的苯甲醇对成品中游离硫酸根的常规定量无干扰，完成系统适应性、专属性、定量限、检测限、重复性、中间精密度、线性与范围、准确度，溶液稳定性，耐用性项目的验证。方法的验证范围是考虑到依诺肝素钠注射液成品中游离硫酸根的限量值，在美国批准为0.12%，在欧洲批准为0.04%[15]，在依诺肝素钠注射液预充针和西林瓶规格中均是如此。
表3.1实验数据汇总
项目 | 接受标准 | 结果 |
系统适用性 | 空白溶液在硫酸根保留时间处无干扰； 系统适应性溶液中硫酸根与草酸根的分离度R≥1； 线性相关系数R2≥0.99。 | 空白溶液在硫酸根保留时间处无干扰； 系统适应性溶液中硫酸根与草酸根的分离度R为1.3~1.6； 线性相关系数R2=1.00。 均符合规定。 |
专属性 | 专属性溶液与供试品溶液中硫酸根相对保留时间应95%~105%。 | 标准溶液与供试品溶液中硫酸根相对保留时间为99%。 均符合规定。 |
重复性 | 由同一实验人员，重复测定一批相当于100%浓度水平的供试品溶液6次，计算RSD，应≤10.0%。报告SD、0.95置信区间 | 同一批供试品(硫酸根含量)6次检测的结果RSD=2.8%，SD=0.34%，0.95置信区间为0.120%-0.127%。 均符合规定。 |
中间精密度 | 每个人测得的6次结果的RSD≤10.0%，两人所有测得的12次结果的RSD≤10.0%，并计算95%置信区间、SD、RSD。 | 一人6次的结果RSD为0.7%，SD为0.08%，95%置信区间为0.117%~0.118%； 两人12次结果的RSD为3.3%，SD为0.4%，95%置信区间为0.118%-0.123%。 均符合规定。 |
检测限 | 计算并摸索出可被检测出的最低浓度，平行配制3份，每份测定1次。记录色谱图, 分析计算测得信号的信噪比，S/N≥3。 | 硫酸根检测限为0.0002%，信噪比为8、7和7。 均符合规定 |
定量限 | 平行制备6份线性最低点溶液浓度(0.1ug/mL)，每份测定1次，记录色谱图，分析计算测得信号的信噪比，S/N≥10，RSD≤10.0%。 | 硫酸根定量限为0.001%，信噪比为32-33，RSD=1.2%。 均符合规定。 |
表3.1（续）
线性与范围 | 检测9个浓度的对照品溶液，相关系数R2≥0.99，Y0/Y100≤10.0%，并报告斜率和残差平方和（RSS）。 | 标准曲线线性相关系数R2=1.00；Y0/Y100= -0.8%。 含量范围：0.001%-0.15%。 均符合规定。 |
准确度 | 定量限回收率在70.0%~130.0%，RSD≤10.0%；100%、125%回收率均在80.0~120%，RSD≤10.0%。 | 定量限回收率为99.59%~100.25%，回收率的RSD=0.4%； 回收率为104.52%~104.81%，回收率的RSD=0.1%； 回收率为106.32%~107.54%，回收率RSD=0.6%。 均符合规定。 |
溶液稳定性 | 1.放置24h、48h供试品溶液中游离硫酸根含量与0h的含量相对偏差≤20.0%； 2.放置24h、48h标准品溶液中硫酸根离子含量与0h的含量相对偏差≤20.0%。 | 1.放置48h、51h供试品溶液中游离硫酸根含量与0h的含量相对偏差分别为1.6%和 0.0%； 2.放置48h、51h标准品溶液中硫酸根离子含量与0h的含量相对偏差分别为1.5%和2.0%。 标准品溶液室温条件下51h稳定。 供试品溶液室温条件下51h稳定。 |
耐用性 | 改变实验中的流速和柱温，最终检测含量与正常条件下的检测含量相对偏差≤20.0%。 | 耐用性考察溶液的含量与正常条件下的相对偏差分别为1.7%，1.6%，1.6%和0.0%。 均符合规定。 |
3.2实验仪器
3.2.1仪器确认
表3.2仪器确认
名称 | 型号 | 计量编号 | 固定资产编号 | 有效期 | 是否有合格标志 |
离子色谱仪 | IC930 | PQC-CO0112 | F02-QC00111 | 2019.12.27 | 是 |
表3.2（续）
电子天平 | XP204 | PQC-FM0043 | F02-QC00020 | 2020.01.17 | 是 |
电子天平 | XP205 | PQC-FM0045 | F02-QC00019 | 2020.01.17 | 是 |
移液器 | 10-100μL | PQC-FU5295 | N/A | 2020.08.14 | 是 |
移液器 | 100-1000μL | PQC-FU5293 | N/A | 2020.08.13 | 是 |
结论 | 符合规定 | ||||
3.2.2试剂和材料
以下试剂和材料用于方法验证实验。
表3.3 标准品、供试品及试剂确认
标准品、供试品 | ||||||||
名称 | 规格 | 批号 | 含量 | 有效期 | 来源 | 储存条件 | ||
依诺肝素钠注射液（含苯甲醇） | USP/EP | Eno20190926-01 | 10000IU/mL 15mg/mL | 2022.09.25 | NKF | 室温 | ||
试剂 | ||||||||
名称 | 规格 | 批号 | 有效期 | 生产厂家 | ||||
无水碳酸钠 | 500g/bottle 500g/瓶 | G1612071 | 2020.05.18 | Aladdin 阿拉丁 | ||||
硫酸 | 500mL/bottle 500mL/瓶 | 190701098J | 2020.11.17 | 南京化学试剂股份有限公司 | ||||
硫酸钠 | 500g/ bottle 500g/瓶 | SLBN9500V | 2019.11.21 | Sigma | ||||
草酸钠 | 100g/ bottle 100g/瓶 | BCBP5941V | 2021.01.13 | Sigma | ||||
苯甲醇 | 5mL/ bottle 5mL/瓶 | BCBQ4591V | 2020.11.17 | Sigma | ||||
硫酸钠 | 500g/ bottle 500g/瓶 | SLBN9500V | 2022.07.05 | Sigma | ||||
结论 | 符合规定 | |||||||
3.3试验方法
3.3.1色谱条件
表3.4实验色谱条件
仪器 | 万通930型离子色谱 |
色谱柱 | AS11（2*250mm）和AG11（2*50mm）阴离子色谱柱 |
检测器 | 电导检测器 |
流动相 | 3mM Na2CO3 |
再生液 | （5mL→1000mL）硫酸 |
流速 | 0.25mL/min |
进样体积 | 20μL |
运行时间 | 25min |
3.3.2溶液配制
淋洗液（3mM Na2CO3）：称取0.32g（±0.02g）碳酸钠于1000mL烧杯中，量取超纯水1000mL溶解，摇匀，超声即得。
再生液：精密吸取硫酸溶液5.0mL，量取超纯水1000mL溶解，摇匀，过滤超声即得。
系统适应性溶液：称取无水硫酸钠约44.4mg、草酸钠约76.1mg置100mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度。精密吸取100μL置10mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即得（硫酸根浓度3μg/mL，草酸根浓度5μg/mL）。
剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：17800字
