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使用DNA条形码鉴定草药材料

1（中国西部植物资源与植物资源国家重点实验室，香港中文大学中医研究所，Shafm，N.T. ，香港，中国）

2（广东省中医药现代化国家工程研究中心，珠海519020）

3（香港中文大学生命科学学院，沙田，中国香港）

摘要 为了保持健康和治疗疾病，草药药物已经在世界范围内被使用了几个世纪。然而，由于安全性和有效性的原因，草药掺假仍然是用户和行业的主要关注点。从1990年代中期开始，通过DNA技术鉴定草药材料的技术已得到广泛应用。近年来，使用四个标准条形码的全球植物物种的DNA条形码（rbcL.matK，trnH-psbA和ITS）一直是生物多样性和保护领域的重点。DNA条形码也可以用作可靠的工具，以便于鉴定草药材料安全使用草药，质量控制和法医调查。许多研究已经应用了这些DNA条形码用于鉴定草药物及其掺假物使用标准DNA条形码和其他基于DNA序列的草药鉴定标记。

关键词 DNA条形码，草药材料，内转录间隔物（ITS），matK，分子鉴定，rbcL，trnH-psbA。

广泛使用草药材料维持健康和治疗疾病可以追溯到许多文化和地区的史前时代。今天，世界80％的人口使用传统医学进行医疗和治疗（世界卫生组织，2008年）。中国使用草药的历史悠久。这种草药，由超过10000种2000多属400科组成（Chen et al。，2010）。国际药用植物市场草药和药品是巨大的，而且还在增长。草药产品的年收入在2005年中国总额达到40亿美元，同比增长5美元2004年西欧数十亿（世界卫生组织，2008）。随着草药市场的增长，香草药材的加药上升为全球的关注。草药可能取代与其密切相关的物种或掺杂有意的物质（但是，1994年; Shaw等人，1997; Tomlinson等人2000）。中草药的掺假通常是由于：（i）不具有容易区分的形态特征的材料;（ii）材料共享相似的通用名称;（iii）用廉价的药材代替经济上有价值的材料。政府和制药业有义务确保任何药用材料是真实的，并且它们是安全和有效的。鉴定草药物料使用传统的感官和化学方法有时是困难的，特别是那些来自植物加工部分或粉末形式的材料。因此，准确，通用，稳定和允许非专家从微量元素鉴定源物种的特异性标记无疑是有益的。分子技术被认为是用于鉴定草药的可靠的替代工具（Shaw等人，997; Kaplan等人，2004 ）和DNA条形码是制定通用标准的最新举措（Chen et al . ，20 l 0：Heubl，20 10）。近年来，DNA条形码已经成为生物多样性和保护领域的重中之重。因此，我们考虑使用DNA条码用于质量控制和法医调查。使用DNA条形码方法鉴定药材保护消费者免受意外中毒或被不诚实的供应商欺骗。此外，DNA条形码可以作为一种法医工具，来帮助检测危及生命的病例中的有毒草本材料。在1990年代我们是第一批应用DNA条形码方法鉴定人参的组织之一（Ngan et al. , 1999）。

DNA条形码是一个用于鉴定物种的基因组的短的DNA序列标准部分。首先从真实植物物种的凭证标本提取总基因组DNA，然后使用通用引物对条形码区域进行PCR扩增和DNA测序（表1）。应用DNA条形码的概念Hebert首先提出了全球物种的鉴定等（2003）获得了显着的发展。从那时起，根据“生命数据系统条例”（http：//www.boldsystems.org，2011年2月25日），截至2011年2月，共有超过1万个DNA条形码记录95000种。过去10年。已有超过18000个DNA条码序列记录在植物中GenBann（http//www.cbi.nlm.nih.gow ,Accessed 2011年2月25日），与2000多个出版物相关（图1）。为了规范国际上使用DNA条形码，科学界有大量努力寻找合适的DNA区域来条形码化每个物种（Kress等，2005;Kress＆Erickson，2007; Min＆Hickey.2007; CBOL Plant Working Group，2009; Chen et al.，2010：Vijayan＆Tsou，2010; Yao et al.，2010）。经过反复评估和应用，显而易见，合适的DNA条形码应符合以下标准：（i）高度的普遍性，以便能被排序常规地跨越植物物种;（ii）高序列质量和覆盖范围，适于生产具有最小不明确碱基对的双向序列;以及（iii）高鉴别能力以使大多数物种得以区分。线粒体细胞色素的部分区域c氧化酶l（COI）650 bp已被用作动画的标准条形码。尽管该地区已被证明在识别鸟类方面非常有效（Kerr et al。，2009），鱼（Zemlak et al。，2009）和昆虫（Bertsch，2009;Zhou等，2009），除了线粒体基因组结构的快速变化之外，由于不足的变化和物种鉴别率低（Cho et al。，1 998,2004），它不太适用于条形码植物植物（Adams＆Palmer，2003）。寻找替代条形码显示，内部转录间隔区（ITS）的核区域和trnH-psbA基因间隔物的叶绿体区域具有高序列变异和种间差异，并且容易在多种开花植物中扩增（Kress等，2005）。此外，已经发现，核糖核酸 - 二磷酸羧化酶（rbcL）和maturase K（matK）基因的大亚基的叶绿体编码区域是在高度普遍性，质量和序列覆盖度方面测试的基因座的合适的DNA条形码，以及鉴别能力（CBOL Plant Working Group，2009）。因此，普遍同意rbcL和matK区域可以作为标准条形码，ITS和trnH-pSbA区域用作陆地植物的互补条形码。使用这些标准DNA条形码，草药材料及其掺假剂的身份称为适当的在本次审查中，我们讨论了使用这些标准条形码和其他基于DNA序列的标记来鉴定草药材料。还提供了其当前应用的统计数据。

1 DNA条码用于鉴定草药材料

中草药的掺杂剂可以是源自密切相关的物种或物种，因此，DNA条形码数据库由DNA序列组成，可以在不同的分类水平上进行区分，为物种鉴定提供参考序列是必要的。最近我们构建了第一个在线DNA条形码数据库，药材DNA条码数据库（http://www.cuhk.edu.hk/icrn/mmdbd.htm,accessed 2011年2月25日），供用户检索和分析药材的DNA序列（Lou et al .，2010）.Tlle数据库包含约20 000个“中华人民共和国药典”（中华人民共和国药典）2010年和“美国药典”美国药典（美国药典，2000年）。四种标准DNA条形码占医药品种数量的50％以上.ITS区域是最常用的（28％），其次是trnH-psbA（9％），rbcL（8％），和matK（8％）区域（图2）因为叶绿体trnH-psbA基因间隔子和核5s rDNA间隔基也常用作基于DNA序列的标记物。这些DNA条形码和标记物在鉴定中的应用草药材料总结表2。

1.1内部隔离垫片

ITS地区包括ITS1基因间隔物，5.8s rDNA和ITS2基因间隔物（ITS1-5.8s-ITS2），尺寸范围从400到gt; 1 000 bp。这是植物系统发育研究中最频繁的测序区域，因为其物种鉴定性较强，技术上易于扩增（AIvarez＆Wendel，2003; Kress等，2005）。同样地，它是最常用的区域用于草药材料的条码识别（图2和表2）例如，ITS区域提供了最多数量的特征字符，并且在六个基因座中具有最高的分辨能力（Katehed et al. ,2008）ITS地区被成功地用于区分14种Hedyotis L.物种，其中包括从H. dlffusa Willd衍生的抗肿瘤草药“白胡沙舍”的真品种。 （L. et al。，2010a）。低种内变异（lt;0 5％）和高特异性差异（16％）使得ITS区域适合于鉴别这些两种物种使用基于该条形码的法医信息核苷酸测序（FINS）方法，我们发现香港（中国）和波士顿（US）市场上销售的七种沐浴露中的四种样品都被H.corymbosa（L. Lam（Li et al. ,20I0a）.ITS区域也可用于从其他家族中衍生自其他家族的物种的掺假物，如Sagina japonicna（Sw.）Ohwi,Stellaria alsine Grimm和Arenaria serpyllifolia L.在Caryophyllaceae和Molluaceae中的Mollugo L.species，共有103个信息性位点多态性（Liu＆Hao，2005）。尽管一般来说，变异和物种的差异较大，但ITS区域的种间变异在一些情况下较低。例如，它不能区分许多在中华人民共和国药典中被认为是草药“疣头”的罗非鱼（A.carmichaeli Debeaux）和阿克苏诺芙蓉（A.kusnezoffii Rchb）（罗阳，2008）.ITS区域也无法区分来自B.scorzonerifolium Willd。的柴胡（香蕉科），均被视为“柴湖”（Wu et al。，2005）。此外，

ITS地区未能区分这两种Chaihu物种与来自B.marginatum Wall.ex DC的掺假物。虽然，B.scorzonergfolium Willd.从B.chinense DC和七种其他柴胡L.species分离使用最大简约分析，ITS区域不能区分B.loriradiatum Turcz的B.scorzonerifolium Willd.（Yang等，2007）。

ITS2基因间隔物已被证明在鉴定属于48个家族的55种加工药草中的药用物质（Chiou et al.，2007）是有价值的。ITS2区域容易地将24种药用物种和66种相关物种分化属等级，也可以区分物种的80％物种。使用ITS2地区鉴定了来自750个属的4800种植物的成功率达到92.7％（Chen et al. ,2010）。高变异性和差异性的ITS2基因间隔物是用作药物的新型通用DNA条形码的有力论据植物（Chen et al。，2010）。ITS2区域的高度种间差异和低特异性免疫是密切相关物种分化的主要优点。例如，变异性在豆科植物中，该区域的平均种内差异为1.7％（范围为0％至14.4％），平均种间差异为8.6％（范围0％-68％; Gao等，2010）。在鉴定石斛兰（兰德兰科），兰科植物（Lindchine Lindindin），丹参（D.fimbriatum Hooker）和密切相关的石斛属植物（Dendrobium Sw.species）的“石虎”中，平均种间变异为12.4％，而种内病毒感染率约为1％ （Lau等人，200mu;l）。这些实施例证明ITS2基因间隔物是能够鉴定植物物种和草药的强大工具。

虽然ITS区域和ITS2基因间隔区可以通过DNA测序来帮助识别草药材料，但由于存在多个拷贝，这些区域有时需要克隆，二级结构的问题导致质量差序列数据（Baldwin等人，1995; Alvarez＆Wendel, 2003）。真菌污染在草药材料中是常见的，其被不正确地加工和储存。使用通用引物容易地扩增真菌ITS序列，产生沉积PCR要克服这个问题，需要设计植物特异性引物（Zhang et al. ,1997;Cullings与沃格勒，1998）。

1.2 trnH-psbA基因间隔物

大多数开花植物的trnH-psbA区域的大小范围在340和660bp之间。该区域在测试的九个基因座中显示出最高的放大成功率（100％）和辨别率（83％），包括ITS，rbcL和matK （Kress等人，2005; Kress＆Erickson.2007）因此，该基因间隔物似乎是分化的有用区域来自它们的掺假剂的药用植物。例如，trnH-psbA区域已经被用于区分来自A.carvifolia Buch.-Ham.ex Roxb的掺假的药用物种青蒿（Asteraceae）和A.Caillis Thunb. 。采用木村2参数分析（Liu＆Ji.2009）。此外，trnH-psbA区域有效区分各种石斛兰种类，种间变异相对较高（范围从0.3％到2.3％）和种内变异（范围从0 ％〜0.1％：Yao et al。，2009），也用于区分来自石斛属植物的兰花（兰花科）的兰花衍生的石虎的掺假，序列发散范围为2 ％〜3.1％（Yao et al。，2009）。trnH-psbA区域的有用性进一步证明了从巴黎Polyphylla var.chinensis（Franch。）的根茎中分离得到的草药(“Chonglou” ）H.Hara（Melantaeaceae）和P.polyphylla var.yunnanensis（Franch。）来自Valeriana jatamansi Jones（Caprifoliaceae; Yang等，2010）的掺杂剂的Hand-Mazz trnH-psbA区域的扩增技术易于扩增，并且其物种分化能力已引起我们关注使用FINS的法医学调查近来，我们使用trnH-psbA区域从其替代品（Li et al。，200l b）中区分来自马蹄莲（Aristolochia contorta Bunge）（Aristolochiaceae）和A.debilis Siebold＆Zucc.的镇咳药草药“Madouling”。在该研究中我们透露，台湾和云南（中国）的两个Madouling样品含有一种心脏（Endl。）Lindl.species（百合科）作为替代品，而广东和甘肃（中国）的样品是真正的Madouling。虽然trnH-psbA区域可用于鉴定许多草本物种，它无法区分柑橘柑（Rutaceae）（C. grandis（L.）Osbeck）和其他几种柑橘属（Su et al。，2

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