英语原文共 15 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

DNA条形码技术首次对埃及园艺植物的研究

及其在园艺产业方面可能(潜在)的应用

摘要：

条形码依赖短期和标准化的基因区域来确定物种。条形码等作为市场监管和版权保护的农业和园艺应用的探索很少。在埃及北部的私人和公共苗圃植物物种鉴定，考察了标准植物条形码标记 （matK、 rbcL） 的有效性。这两个标记从 161 物种和 62 重要性的植物家庭园艺共225个标本进行了测序。序列恢复了类似 rbcL （96.4%) 和 matK （84%)，但正确地分配给各自属的样本数目和物种是： rbcL （75%和 29%） 低于 matK （85%和 40%）。结合rbcl和matk,确定了正确的泛型和物种的分配数量，分别是83.4%和40%。个别的，两种分子标记的效率在不同植物的家庭中有差异;例如，所有棕榈标本 （棕榈科） 被正确地标记到了物种，然而只有一个个体的菊科被正确都标记到物种。而且，观赏园艺和药用植物条形码能够正确分配到属，虽然在标记到这些植物种类和品种方面他们表现出较低的或者未成功的现象。未来，我们推荐一个互补的条形码 （例如 ITS 或 trnH、psbA） 与 rbcL matK 组合来增加分类识别性能。通过园艺作物和观赏棕榈物种鉴定的协助与条形码区域的分析，这将对园艺产业产生很大的影响。

介绍：

全球园艺产业是农业发展最快的行业之一。据美国经济分析局的统计，2012年美国的花卉相关销售额为278亿美元，而全球产业销售额超过600亿美元。不幸的是，全球园艺产业市场受到广泛的假冒观赏植物和水果植物的破坏，没有任何人支付知识产权或遵守植物品种保护（PVP）法[1,2]。园艺作物知识产权侵权可能导致植物育种人员的巨大经济损失，包括中小型公司和公共研究机构的主要收入和授权生产者支付的执照费用，而非法贸易商则无视付款，这一结果不仅对生产者有影响，而且对社会和全球贸易也会产生不利影响[3]。面对假冒观赏植物和业内许多其他非法活动，开发可靠的方法来区分观赏植物，水果和蔬菜的物种或标本，可能有助于通报和执行市场规定[4]。传统上，大多数植物鉴定都是基于形态特征，但是这种鉴定并不总是可靠和有效的[5]。广泛的分子技术包括（但不限于）随机扩增多态性DNA（RAPD）[6]，扩增片段长度多态性（AFLP）[7]，限制性片段长度多态性（RFLP）[8]，微卫星[9]并提出了单核苷酸多态性（SNP）[10]来鉴定植物物种/标本和品种。DNA条形码已经成为一种相对较新颖和可能更普遍的工具，用于分析植物和动物的多样性，并将标本分配给其物种，即使没有全部或主要形态学诊断特征[11,12]。与DNA条形码的表现相比，仍然存在一些与DNA条形码表现相关的储备，例如，早期的形态研究，通过 DNA 条形码彻底比较性能和基于数学形态学的物种鉴定记录数目形态的局限性，尤其是它的隐性物种[5]。

最早使用DNA条形码识别昆虫物种[11]引发了一场全球运动，动员了科学家和机构进行生物多样性，生态学和系统发育研究[13-17]。该技术已经成为可接受的分类工具[18]，并已成功应用于大型生物多样性项目，其中记录了区域动植物[15,17,19]，包括受规管和受威胁的分类群[20]。尽管包括trnH-psbA [21]，rpoc1，rpoB [22]，trnL [23]，rbcL [24]和matK [25]在内的许多植物基因最初被提出为基于可恢复性序列的潜在植物条形码质量和水平的物种歧视，生物条形码联盟[12]建议将rbcL matK的2位基因组合作为标准植物条形码。 然而，持续调用将ITS包含在核心条形码中[26-28]。

这种组合rbcL matK在各大洲的几个标本识别运动中取得了成功，例如喀麦隆非洲热带雨林的条形码运动[29]，埃及的树木和灌木[13]，巴拿马的森林[30]， 和澳大利亚着名的植物区系[31]。同样，对条码具体分类群等园艺作物如罗 [32]、 榕 [13,33]、 杜鹃 [34] [35] 五加科的几个项目已经启动。

具体来说，中国一直关注药草植物[36]，非洲大陆只有在南非，才对DNA条形码局部和区域花卉做出了特别的努力[15,16,28]。 然而，在北非，特别是在埃及一个有前途的生产观赏作物[37] 和其药用和园艺植物多样性 [38]的国家，一个非洲北部著名的国家，地方和区域花卉的条形码工作尚未得到推动 DNA条形码应用范围广泛的科学学科正在加速发展；例如入侵生态学 [4，39]、 生物多样性评估 [15]、 [16,40] 的保育工作和系统地理学研究 [40]。

目前的研究是埃及和北非的第一个倡议，目的是在私人和公共苗圃中条码化埃及观赏草药和棕榈树，具体来说，我们使用我们生成的核心DNA条形码（rbcLa matK）数据来探索分类群和标本鉴定中每个标记的分辨率。本研究中生成的DNA条形码数据将用于商业农业，园艺和药用植物行业，以控制假冒产品，也可用于当地植物区系的生态研究[4,16，40]。

材料和方法

植物材料和组织样本

我们从161个种群收集了225个植物标本，其中，121份样本，是从亚历山大绿色绿洲苗圃取样，85份是从亚历山大科学院的苗圃取样，12份是从亚历山大蒙大纳地区的苗圃取样，5份是从亚历山大马里奥特区的卡迈勒地区的苗圃取样，还有2份是从亚历山大安东尼德斯花园中取样（2016年5月）。苗圃和花园的所有人都批准了数据的抽样和出版，没有一个植物是濒危或受保护的物种。为了检查观赏植物品种条形码的成功，收集了属于相同物种的几种个体，花或叶颜色不同的个体，包括三色堇和瓜叶菊等。样品收集、分析和购物凭证于2016年5月完成。 用数字图片进行地理参考和叶片样品在硅胶中干燥以进行后续分析。 样本信息以及图像可在埃及生命项目条码（www.boldystems.org）和S1表中找到。

DNA提取，PCR和测序

在加拿大安大略省生物多样性研究所DNA条形码中心（CCDB）进行DNA提取，PCR扩增和测序。 DNA提取，PCR扩增和测序按照CCDB协议（S1和S2片）进行。使用以下引物进行扩增和测序：

rbcL：rbcL-F（TGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC）[41]，

rbcL R（GTAAAATCAAGTCCACCRCG），

matK：MatK-1RKIM-f（CCCAG TCCATCTGGAAATCTTGGTTC），

MatK-3FKIM-r（GTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG）。

使用CodonCode Aligner V 3.5.4（CodonCode Co.，USA）进行排序后，将正向和反向跟踪文件进行了修整和组装。 生成的所有序列可在Genbank / EBI（matK登录号KX783623-KX783811; rbcL登录号KX783812-KX784028）获得

数据分析

进行针对GenBank数据库的BLAST测试，用于鉴定家族，属和物种水平的标本，并且基于Blast1方法（BLAST1：ID是与最佳BLAST命中相关联的物种与E值相关的lt;切断。这对应于选择最流行的BLAST结果）[42]。正确的识别意味着个人被分配到正确的物种，属或家庭;歧义识别意味着个人被分配到一个或几个物种，属或家庭，包括正确的;不正确的识别意味着个人被分配到一个或多个物种，属或不包括正确的物种的家庭[43]。TAXON DNA [44]用于评估数据集中种间和种内距离的分布。条形码差距使用在Boldsystems实现的K-2参数距离模型进行matK和rbcL的分析[45]。使用TAXON DNA的“共识条码生成器”功能获得每个物种的共同条形码[44]。在MEGA6 [47]中使用基于K-2参数[46]方法计算的进化距离，在matK，rbcL的相邻连接（NJ）树和组合的rbcL matK序列中使用共识条形码。使用MUSCLE [48]通过成对删除和Bootstrap系统发育测试的500次重复进行序列修剪。在MEGA6之间进行距离分析，家庭之间，家庭内和物种间使用共识条形码序列。对于matK和rbcL，使用DnaSP v5 [50]计算分离位点数和核苷酸多样性值，其为一对随机选择序列之间的每个位点的平均核苷酸差异数[49]。所有对准均可作为S1-S3对齐。

结果

测序成功

225个植物标本的PCR扩增产生217（96.4％）rbcL和189（84％）matK序列。我们收集了161种植物，其中98.1％被成功地测序为rbcL，83.9％为matK。 rbcL和matK的序列长度分布分别为506-552bp至468-894bp。最大的matK序列（894bp）是由番薯，薄荷和合果芋产生的，而马蹄莲中是最短的（468bp）。对于rbcL，除了紫荆花（520bp），罂粟（531bp），绣线菊（529bp）和罗莎杂交（215bp）中的少量短片段外，rbcL大多数种类生长着相似的长度（552bp）。 GC百分比从27.98到83.34，平均为33.64，而rbcL则为40.29至43.30，平均为36.38。对于rbcL和matK，每种物种的平均样本数分别为1.44和1.45;测序成功在家族之间有所不同（S2表）。在MatK中，几种成虫（12.5％），马鞭草科（57.14％）和芸苔科（66.7％）的成功率最低。此外，一些单体家族（由一个成员代表）在matK中没有扩增或测序，如木瓜科，草纲科等。 rbcL显示100％的扩增和测序成功与大多数家庭，除了家庭林科，槐科，南极科，香米科和菊科的很少的成员。药用和园艺家族如唇形科显示高序列回收率（100 matK，91.3％rbcL）。

物种分辨率和条形码分析

使用matK序列，分类群在家族，属和物种水平上分别为100％，85.2％和39.7％，而对于属和物种水平，分类群分别为6.9%和36.5%。 不同的matK鉴定，对于属和物种水平，分类群分别为7.9%和23.8%（表1）。 rbcL序列鉴定在家族，属和物种上分别为100%,74.65%和29％，而属和物种水平分别为13.8和38.2％。 不同的rbcL鉴定，对于属和物种水平，分类群分别为11.5%和32.7％。MatK和rbcL序列串联正确分配83.4%分类群39.8%的物种及其属虽然它隐约分配属的11.6%和46.9%的物种。通过串联rbcL和matK，不正确分配了唯一的属的4.9%和13.3%的物种。

在Taxon DNA中，所有数据集的两个条形码位置中的成对种间距离范围为0.0-2.7％（表2）。 rbcl matK显示出比任一标记更高的平均物种内值。成对平均种间距离在rbcL中较低（0.4％），在matK中为（1.3％）。串联的条形码位点的连接并没有增加种间平均距离（表2）。数据显示个体或组合序列的种内和种间距离之间的重叠（表2）。在rbcl matK（97.2％）中，rbcL（89.3％）和matK（89.4％）之间的重叠没有差异。条形码差距分析提供每个物种内距离的分布以及距离每个物种的最近的距离。在K-2参数距离模型（成对删除）下使用条形码空白分析工具对BOLD进行matK序列比对，显示出比指示条形码间隙存在的平均内部距离（0.01）更高的平均距离（4.7）。基于189个matK序列，22个物种显示较高（gt; 2％）的种内发散，52个显示较低（lt;2％）的种内发散。 rbcL显示出比平均种内（0.0）距离更高的平均值（2.3）。 217个rbcL序列的分析显示23种具有较高（gt; 2％）种内距离和91种具有较低（lt;2％）的种内距离。

序列分析

家庭和属聚类

使用来自每个家族的至少一个序列的182个序列（S1图）产生用于rbcL matK的NJ树。 每个家庭的成员聚集在树上，在matK（S1图）或rbcL matK树中具有最大的家族唇形科的簇。此外，每个属分为子群。 在茄科中，共有6个属13个子群， 条形码分离了所有属，但并没有分离大部分物种。 通过两个标记物分析天竺葵科成员，并形成两个亚群，一个连接到丝兰和绿藻属，第二个连接到龙血树，桑叶草，芦笋和堇青霉素（S1图）。在沙眼科中，检测了9种。 沙棘科在matK和rbcL matK中分化，但形成一个簇。紫花苜蓿，蓬莱蕉，红掌， 万年青属被两个基因座位点分开，除了属于喜林芋的三种物种。

属和物种的简单诊断特征

薄荷属显示简单的诊断特征，作为当地物种中的两个多态位点将该属分为三种不同的单倍型（图1）。第一个包含459-T和670-G，仅在欧薄荷中发现，而第二和第三个单倍型（459-C和670-A / 459-C和670-G）在苹果薄荷和薄荷属中发现，在香茶属（唇形科）中发现了两种单体型的matK。其中一个有678-T（马达加斯加）和第二个678-G（ 西班牙百里香）与前者的叶片杂色形态变化有关。在鼠尾草（唇形科）中，在每个基因座中发现两个单体型;其中一个与狗尾草属相关，两种物种在紫菜科没有显示诊断字符，虽然前者显示清楚的亚种之间的形态差异。在矮牵牛中，检测了3种，发现了每种matK和rbcL中的两个单倍型。甘草在每个条形码标记中具有自己的单倍型，而瓜叶莲杂种品种包含每个条形码的每个单倍体，并且每个条形码标记基于单核苷酸多态性将瓜叶莲杂种品种分成两组。在龙血树中，四个形态发散物种被条形码化，每个条形码在每个基因位点中产生四个单倍型的情况下精确地区分每个物种。此外，其他种类的天竺葵科如紫花苜在两个基因位点中都产生了两个单倍

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[138103]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word