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地衣芽孢杆菌小规模连续培养生产gamma;-多聚谷氨酸的代谢研究

Anja Wilming ^a , Jens Begemann ^a , Stefan Kuhne ^a , Lars Regestein ^a , Johannes Bongaerts ^b , Stefan Evers ^b , Karl-Heinz Maurer ^b,1 , Jochen Buuml;chs ^a,

摘要

对于微生物的培养，常常使用摇瓶。培养期间发酵液的粘度没有受到特别关注。然而，粘度的变化可能对摇瓶培养产生严重的影响，对传质和传热的影响甚至会导致发生相变。合成培养基上对地衣芽孢杆菌分批培养，观察到粘度发生显着变化。形成的生物聚合物被鉴定为聚谷氨酸（gamma;-PGA），是芽孢杆菌作为副产物排出的。 gamma;-PGA会导致粘度增加，因此对摇瓶培养具有关键影响。因为氧传递很受粘度的影响，所以gamma;-PGA的形成对其会有影响。此外，gamma;-PGA具有螯合特性，其可能影响营养物和微量元素的利用，即导致底物限制。总而言之，这些影响导致发酵过程中的条件不好确定，因此，我们研究了gamma;-PGA产生的触发因素。通过进行连续培养实验和脉动实验，确定了gamma;-PGA生产的关键触发因素之一是分解代谢物阻遏。结果表明，分解代谢物阻遏导致2-酮戊二酸复合物的结合，令2-酮戊二酸的积累和谷氨酸到gamma;-PGA的代谢通量重新定向。此外，氧气限制被确定为会进一步增加gamma;-PGA产生。因此，需要严格避免有利于分解代谢物阻遏和氧气限制的发酵条件，以确保整个发酵期间处于低粘度条件。

关键词：

生物反应器 粘度 发酵 蛋白酶 地衣芽孢杆菌 聚谷氨酸

1.介绍

地衣芽孢杆菌的代谢研究非常重要，因为革兰氏阳性土壤杆菌的衍生物在工业常用于酶的大量生产。比如地衣芽孢杆菌以及其他芽孢杆菌属的细菌，能够分泌大量的细胞外酶，它们被大量用于洗涤剂行业的蛋白酶生产。特别是枯草杆菌蛋白酶家族的产品，现在用于洗涤剂中。 2002年，各类工业市场蛋白酶占酶总销售量的约40％。在欧盟内部，2002年生产和使用了约900吨纯酶。在芽孢杆菌菌株的发酵过程中，大量的聚谷氨酸（gamma;-PGA）会产生不希望得到的副产物。由于聚合物gamma;-PGA导致发酵液粘度增加，在发酵过程中可能会引起严重问题。因此，良好的控制过程，应避免容易导致高粘度的条件，从而提高生产率。为了实现这一点，必须充分了解gamma;-PGA的合成机制。

尽管存在这些挑战，地衣芽孢杆菌现在仍常常用于生产聚谷氨酸（gamma;-PGA）。 gamma;- PGA具有很多特性，水溶性、阴离子、无毒性聚合物，可用于药物释放方面，作为化妆品中的保湿剂，以及作为食品中增稠剂，冷冻保护剂或老化抑制剂。它的多功能应用使人们对其在工业上的使用感兴趣，已经有几组科研人员详细研究了gamma;-PGA的形成]。实验室规模中最常用的gamma;-PGA生产方法是Leonard首先发表的。所使用的培养基E含有甘油、柠檬酸盐以及作为碳的谷氨酸和高浓度的碳源和能源（分别为80g / L，12g / L和20g / L）。当在摇瓶和发酵罐[12]中使用培养基E 时，报道了高gamma;-PGA产物浓度（12g / L-23g / L）。 例如Cromwick等人，在pH控制的发酵罐中使用培养基E，研究了地衣芽孢杆菌ATCC9945A的gamma;-PGA形成，发现与低通气（250rpm，0.5vvm）相比，在pH6.5和高通气（800rpm，2vvm）条件下培养，观察到gamma;-PGA形成增加了。在1980年代，Frankena等人报道，3.8g / L浓度的柠檬酸已经对地衣芽孢杆菌具有碳分解代谢阻遏物的作用。因此，上述研究最可能是在碳分解代谢阻抑（CCR）下进行的，因为培养基E含有三倍以上的柠檬酸盐。

Dauner等人研究了碳限定和碳过剩条件对枯草芽孢杆菌相关近亲代谢的影响。在进行连续培养实验的同时，Dauner等在碳限定条件下观察到高活性的三羧酸（TCA）循环。此外，他们观察到TCA活性随着稀释率的增加而降低。低稀释率导致高水平的碳限定，因此失去了碳分解代谢物的镇压作用，导致碳源的积累，接近洗脱的较高稀释度代表碳分解代谢物受到抑制，表明随着稀释倍率的增加，观察到的TCA循环活性降低可能与碳分解代谢物的抑制有关。除连续培养实验外，我们还完成了初始碳浓度较高的分批实验，观察到的TCA活动由于非常强的CCR而接近完全抑制。此外，Thorne 观察到产生gamma;-PGA的枯草芽孢杆菌培养物中的2-酮戊二酸积累，这是2-酮戊二酸作为gamma;-PGA的前体的明显指示。 1973年，Troy等人在上述培养基E的批次实验中进行了生物合成的综合表征以及地衣芽孢杆菌gamma;-PGA的结构方面的表征。在这些研究中，2-酮戊二酸被证实为gamma; - PGA的前体。由于在培养基内，特别是柠檬酸盐中的高碳含量浓度，碳分解代谢物的抑制最有可能盛行，直到柠檬酸盐被完全代谢为止。因此，碳分解代谢物的抑制可能与观察到的TCA抑制相关，并导致在高碳浓度下2-酮代戊二酸的分解代谢物控制积累，这里称为分解代谢物阻遏。根据 Cromwick等人、Dauner 等人和Troy等人的观察，得出了地衣芽孢杆菌中由CCR引起的分解代谢物阻遏导致代谢通量重新定向至PGA生产的假说。

在大肠杆菌中，氧限制对于在芽孢杆菌中的CCR和分解代谢物阻遏观察到的TCA具有相似的作用[20]。 因此，在分批和连续生产中也研究了氧限制对gamma;-PGA生产的影响。 对于分批实验，使用呼吸活动监测系统（RAMOS），该系统可以通过测量专门修改的锥形瓶（RAMOS烧瓶）的气相中的氧分压来在线监测氧气传输速率（OTR）、二氧化碳转移速率（CTR）和呼吸熵（RQ）。

连续培养方法和脉动实验用于这项工作，因为它们提供了稳态条件，简化了动力学参数的推导。与批次实验相比，培养基组成、粘度以及代谢细胞状态不随时间变化，通过将脉动引入碳限定的连续稳态培养，可以研究不同应力信号对细胞的影响。为了进行连续的培养和脉动实验，我们使用了Akguen等人开发的连续的平行小规模摇动生物反应器系统（COSBIOS）。更多的详细信息，请参阅Akguen等人的工作。

特别是在摇瓶培养中，通过合成生物聚合物（如gamma;-PGA）对发酵液粘度的变化会有显着的影响。高粘度不仅影响传质和传热，而且还影响搅拌器的功率输入、反应器中聚结、物质混合和过程控制。此外，烧瓶中的液压机械条件受到影响，粘度的增加会导致所谓的异相现象。因此，高粘度可能导致液体旋转的破坏，从而导致氧气传输的破坏。由于粘度对发酵过程具有如此严重的影响，本文旨在阐明地衣芽孢杆菌工业生产gamma;-PGA过程中不良副产物的触发因素。

2 材料和方法

2.1 菌株和培养基

蛋白酶生产地衣芽孢杆菌菌株和gamma;-PGA缺陷型突变体由Henkel KGaA（德国杜塞尔多夫）提供。所有化学品均购自Carl Roth GmbH＆Co. KG（德国卡尔斯鲁厄）、Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国Taufkirchen）或Fluka（瑞士Buchs），分析级。

用于连续培养的优化的V3 MOPS培养基配方为每升液体中：葡萄糖20g，MOPS-酸52.3g（0.25mol），MnCl 2·4H 2 O 0.05g，CoCl 2·6H 2 O 0.53mg，ZnCl 2 0.26mg，H 3 BO 3 0.01mg，NiSO 4 ·6H 2 O 0.66mg，CuSO 4·5H 2 O 0.31mg，Na 2 MoO 4·2H 2 O 0.65mg，MgSO 4·7H 2 O 1.01g，CaCl 2·H 2 O 0.026g，FeSO 4·7H 2 O 0.05g，（NH 4）2 SO 4 7.0g， K2 HPO4 3.4g，柠檬酸钠3g，卡那霉素50mg。每个组分按照外观顺序与无菌储备溶液分开加入。使用柠檬酸钠作为螯合剂，以防止沉淀，并通过COSBIOS系统的泵软管进行无阻碍的进料。用5M NaOH将初始pH设定为7.5。用于分批培养的V3 MOPS培养基与改良的V3 MOPS培养基相同，除了缓冲液浓度为41.85g / L（0.2M），（NH4）2 SO4浓度为15g / L，初始pH = 8.0。在分批培养基中不使用柠檬酸钠作为螯合剂。

2.2 培养

培养和脉动实验在重复进行，基本上显示相同的结果。为了简单起见，本工作仅提供了一个数据集。使用两阶段预培养来接种批次和连续的主要培养物。将第一次预培养物从甘油储备液中接种并培养过夜（250mL锥形瓶，棉塞，振荡频率350rpm，振荡直径50mm，填充体积10mL，4％（v / v）接种物，37℃ C）在LB培养基中。从初始OD = 0.4的第一次预处理接种LB培养基中的第二次预培养，并运行直到细胞达到中指数生长。使用RAMOS器件（与上述相同的条件）实现了第二次预培养的监控。对于主批次培养物，接种主混合物，初始OD = 0.4的第二次预培养，并将所需体积转移到不同的RAMOS烧瓶中。对于这些实验，利用了内部制造的RAMOS器件。商业版本可从Kuuml;hner（Birsfelden，Switzerland）和Hitech Zang（Herzogenrath，Germany）获得。

在与RAMOS烧瓶相同的条件下平行培养的普通摇瓶（250mL Erlen-meyer flask，棉塞）中抽取样品，将RAMOS烧瓶和样品瓶从相同的主混合物中接种，因此，有理由假设同步运行。这种技术在以前发表的项目中成功应用。

对于连续培养物，使用COSBIOS，配备六个平行的生物反应器。有关系统组装的详细信息，请参见Akguen等人。我们使用了一个多级的静电泵（IPC-N-8，Ismatech，Glattbrug，Switzerland）输送进料物质。因此，每个反应器可以以不同的稀释速率操作，或者如果需要，可以使用相同的反应器。

对于主要培养物，使用无菌注射器（OD = 0.4，填充体积15.5mL）将所选择的振动参数（如Akguen等人所述）的相应反应器体积从接种的主混合物转移到COSBIOS烧瓶中（350rpm，25mL，200rpm，摇动直径50mm，37℃）。在24小时的批次阶段之后，通过启动多级蠕动泵将反应器系统切换到连续模式。

通过使用接种口和无菌注射器达到稳定状态后，从每个反应器抽取样品。使用5mM H 2 SO 4作为洗脱液和有机酸柱（60℃，流速0.6mL / min）（CS Chromatographie Service GmbH，Langerwehe，Germany），通过等离子体HPLC测定葡萄糖和柠檬酸浓度。对于脉动和振动频率的降低实验，糖尿病患者通常使用血糖测量装置（Accutrend Sensor，Roche diagnostics，Germany）进行葡萄糖定量，因为样品体积太小，无法进行详细的HPLC分析。

2.3 干细胞重量

通过离心2 mL新鲜样品测定干细胞重量。 用0.9％（w / v）NaCl洗涤沉淀，离心（10分钟，17,000times;g），并在60℃下干燥，直到达到恒重，称重前在干燥器中冷却。

2.4 粘度测量

如Kubota等、King等、Goto和Kunioka 所述，由于存在分解gamma;-PGA的聚谷氨酰水解酶，所以形成的-PGA的分子量在发酵过程中可以降低。毫无疑问，分子量的变化影响了发酵液的粘度。因此，选择粘度测量作为遵循-PGA形成的第一个一般方法。然而，未来必须进行定量和分子量分析，以支持本研究中提出的结果。

来自Anton Paar（奥地利格拉茨）的MCR 301流变仪用于使用锥板测量技术（角度0.467◦）和圆锥尖端的间隙宽度为0.054mm的粘度测量。使用0.5mL新鲜样品的体积在25℃下进行粘度测量，并应用100至3000的剪切速率范围。由于gamma;-PGA溶液表现出假塑性性质，使用明显的剪切速率= 300的粘度值来比较实验。据Peter等人研究，摇瓶中培养期间实际剪切速率在= 300的范围内。

2.5 蛋白酶活性测定

根据DelMar等开发的方法测定蛋白酶活性，人为底物Suc-AAPF-pNA（琥珀酸-1-丙氨酸-1-丙氨酸-1-脯氨酸-1-苯丙氨酸- 对硝基苯胺）切割成AAPF和pNA，导致吸收变化，其可以在405nm测量。无细胞上清液用于活性测定，用含有0.1％Brij 35％的0.1M Tris / HCl缓冲液pH 8.6稀释。将底物Suc-AAPF-pNA（70mg / mL，在DMSO中）用含有0.1％Brij 35％的0.1M Tris / HCl缓冲液pH 8.6稀释20倍。在微量滴定板中，向200mu;L稀释的样品中加入25mu;LAAPF溶液；使用相同量的缓冲液进行空白测量。在加入底物后立即开始动力学测量，随着时间的推移，随着吸收斜率的变化，可以用已知的Suc-AAPF-pNA消光系数（ε405= 8.48cm2 / mol）来计算活性。

2.6 测定COSBIOS中的最大氧气传输能力

我们研究了COSBIOS的最大氧传输能力。从Akguen等人的工作中可以看出，COSBIOS系统中的最大氧气传输能力（OTRmax）主要取决于施加的振荡频率。 Akguen等人使用化学系统（0.5M亚硫酸盐体系）测定振荡频率高达300rpm的OTRmax。有关此方法的详细信息，请参阅Akguen等人。在图1中，OTRmax以振荡频率为变量，越来越高的振荡频率导致OTRmax几乎呈指数增长；应该注意的是，增加的振动频率导致填充量减少，这两个变化导致OTRmax值增加。由于COSBIOS在本研究中以280rpm和350rpm的速度运行，所以这个图对这些频率进行了额外的测量。在280rpm和350rpm下，COSBIOS可以分别向烧瓶中的亚硫酸盐溶液提供34.5mmol / L /

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