基于生物亲和超滤的配体垂钓筛选柑橘类植物黄嘌呤氧化酶抑制剂

摘要：

柑桔属植物是一种珍贵的药用植物，其果实和果皮中含有丰富的黄酮类化合物，具有潜在的降尿酸作用。本研究采用生物亲和超滤法对柑橘类植物中黄嘌呤氧化酶抑制剂进行快速筛选和鉴定。在最佳实验条件下，以黄嘌呤氧化酶为靶标蛋白，筛选出5 个潜在的配体。随后，这五种化合物的化学结构都得到了鉴定。随后，用四极杆飞行时间质谱法鉴定了这五种化合物的化学结构。其中橙皮苷和柚皮苷被证实为高效黄嘌呤氧化酶抑制剂。橙皮苷和柚皮苷的半抑制浓度分别为0.15 mu;M和1.82 mu;M。与临床抗痛风药物别嘌呤醇 (半最大抑制浓度= 8.03 mu;M) 相比，半最大抑制浓度越低，酶抑制活性越高。Lineweaver-Burk图表明，这两种化合物以非竞争性的方式抑制黄嘌呤氧化酶。结果表明，生物亲和超滤法是一种有效的筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。

关键词：生物亲和超滤柑橘植物； 橙皮苷； 柚皮苷； 黄嘌呤氧化酶

1 引言

高尿酸血症 (血清中高浓度尿酸) 可导致慢性痛风，并与心血管疾病和代谢综合征相关，这是死亡和健康问题的主要危险因素^[1]。抑制尿酸的过量产生，避免尿酸在血液中积聚，是治疗上述疾病的有效方法。在次黄嘌呤和黄嘌呤的氧化过程中，尿酸的产生是在黄嘌呤氧化酶 (XOD) 的催化下发生的。因此，XOD被认为是降低尿酸水平的关键指标。当酶的活性被抑制时，尿酸的合成被阻断^[2]。一些XOD抑制剂已经被用作治疗高尿酸血症和相关疾病的最有效的药物^[3]。然而，传统的治疗药物 (别嘌呤醇和非布索坦) 导致严重的副作用。患者在服用这些药物时可观察到肾功能或肝功能受损及过敏反应^[4-6]。研究高效、低毒的XOD抑制剂具有重要的临床应用价值^[7]。

由于天然产物中含有丰富的生物活性化合物，因此倍受关注。柑桔属植物是一种传统的药用植物，含有多种有趣的化合物^[8]。其中黄酮类化合物是主要的生物活性化学成分。橙皮素和柚皮素是两种最常见的类黄酮。它们的糖基衍生物也被广泛检测，包括橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷 (柚皮素-7-新橙皮苷) 和柚皮苷 (柚皮素-7-芦皮苷)。它们具有多种治疗效果，如抗癌、抗糖尿病、抗菌、抗氧化和预防心血管疾病等^[9,10]。此外，一些研究表明，基于苯环上羟基的结构，黄酮具有显著的降尿酸作用^[11]。考虑到柑橘富含类黄酮，我们选择它们作为潜在的靶点来发现可用的抗痛风药物。

基于化学成分的复杂性和生物活性成分的微量水平，从天然药物中筛选潜在的酶靶向抑制剂是一项具有挑战性的工作^[12]。与传统的筛选方法相比，配体垂钓法具有一些固有的优势，包括快速和方便。这是因为靶向化合物是直接从天然产物提取物中捕获的，并且避免了对非靶向分析物的重复分离或纯化过程^[13]。这些方法的建立依赖于配体和酶之间的生物亲和的特异性。在离线模式下，配体垂钓分析、超滤、磁珠固定化酶方法和平衡透析方法被广泛应用^[14]。生物亲和超滤作为一种快速、高通量的筛选技术，其筛选过程分为孵育、分离、离解三个步骤。然后用LC/MS对释放的配体进行分析和鉴定。超滤过程中的关键问题是消除非特异性吸附可能产生的假阳性结果^[15]。一般在进行超滤筛选时，以变性酶为对照组。通过比较活性酶和非活性酶的结果来确定选择性结合物。

因此，采用生物亲和超滤UHPLC-QTOF质谱法成功地从柑橘植物提取物中筛选出了强效XOD抑制剂。此外，进行体外XOD抑制试验，并建立Lineweaver-Burk (LB) 图，进一步阐明生物亲和超滤试验获得的XOD抑制活性和潜在抑制剂类型。图1概述了这项研究的详细描述。

2 材料、仪器和方法

2.1 物料、化学品、试剂

柑桔样品 (桔实、枸杞、桔红) 的果实或果皮均购于中国浙江当地药房。 XOD (40 U/mg) 由Jamp;K化学公司 (上海，中国) 提供。Amicon超0.5离心过滤装置 (10、30或50 kDa截止) 购自美国默克公司 (Merck Milipore, Bedford, USA)。XOD标准抑制剂别嘌呤醇、底物黄嘌呤和产品尿酸均来自中国上海Oka生物科技有限公司。柚皮素、柚皮苷、芸香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的标准品均取自上海温宝医药科技有限公司。甲醇和水为LC-MS级，分别由美国默克 (贝德福德) 和娃哈哈集团有限公司 (中国杭州) 提供。所有其他试剂都是分析级的。

2.2 样品提取物的制备

将干燥后的样品粉碎，用40目筛网筛分，得到均匀的粉体。取准确称量的粉末0.5 g，用800 W超声破碎30 min。这里以100%甲醇为萃取溶剂，料液比1:40 (w/v)。提取液13000 rpm离心10 min。收集上清液，4 ℃保存备用。

2.3 生物亲和超滤法筛选潜在的XOD抑制剂

2.3.1 配体筛选程序

生物亲和超滤筛选参考了之前的报道，并做了一些调整^[16,17]。首先，为了避免有机溶剂的干扰，将上述样品在65℃温度下蒸发，用水溶解。用磷酸盐缓冲液 (PBS) (pH 7.4, 50 mM)将XOD缓冲液稀释至0.4、0.8、1.6、3.2和4 U/mL。然后将2 mg/mL样品提取物(100mu;L)和等量的XOD依次加入到离心管中，37 ◦C孵育15、30、45、60 min。设PBS为对照组，与XOD比较。形成XOD配体配合物，然后完全转移到具有不同截止(10、30和50 kDa)的离心超滤装置上。13000 rpm离心10分钟，保留目标配体复合物。然后，用200 mu;L 50 mM PBS缓冲液 (pH 7.4) 洗去未结合的化合物。离心重复三次。然后，结合的配体通过13000 rpm离心10 分钟，80%甲醇释放。离心重复3 次，每个样品的滤液用UHPLC联合分析。所有的筛选试验都是重复进行的。

酶抑制活性

质谱鉴定

液相分析

分离

离心超滤

孵化

样品提取

图1 BAUF-HPLC-Q-TOF/MS法筛选柑橘植物提取物中潜在黄嘌呤氧化酶抑制剂的原理图

2.3.2 建立的配体筛选方法的特异性

为了消除在配体筛选过程中潜在存在的非特异性结合，XOD在100℃煮10 分钟使酶变性。与样品提取物共孵育作为对照组。HPLC分析结果与正常XOD组进行对比^[18]。

2.4 超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用法分析

所有测试样品均采用安捷伦1290 UPLC系统进行分析。SB RRHP C18色谱柱(100 mmtimes;2.1 mm id, 1.8 mu;m;在30℃条件下，以0.4 mL/min的流速分离目标化合物。分别以水(A)和甲醇(B)为流动相。采用梯度洗脱程序设置如下:10 - 35% B在0 - 4分钟, 35 - 40% B在4-10分钟, 40minus;60% B在10-11分钟, 在11 - 12分钟60minus;100% B, B 10% 13分钟。色谱是恒定的，检测波长为275 nm和注射量是1 mu;L。

根据Agilent 6545 Q/TOF质谱仪获得的质谱识别潜在的配体。利用ESI源在负离子模式下收集各种碎片信息。ESI-MS/MS相关仪器设置如下:毛细管电压3.5 kV；碎片电压165 V，碰撞能量10、20和40 eV；干燥气体(N2)流量；10.0 L/min;护套气温350◦C；雾化器压力：45 psi；全扫描m/z范围为100minus;800。对于定性分析，Mass Hunter工作站软件 (B.08.00版本定性分析；采用了安捷伦技术)。

2.5 XOD抑制试验及抑制方式

为了进一步验证筛选方法的有效性和配体潜在的抗痛风作用，我们根据早期文献[17]的修改方案进行xod抑制试验。然后将0.8 U/mL XOD放入不同浓度的PBS中测试化合物在等效体积混合和预孵育5 分钟在37 ◦C。然后加入100mu;L的底物溶液 (0.42 mM) 引发反应。混合物保持在37 ◦C 0.5 小时，以允许彻底的反应。为了终止反应，加入1 M HCl 80 mu;L。将反应混合物离心后注入UPLC中进行分析。尿酸产物检测波长为295 nm。按照尿酸标准曲线计算尿酸含量。空白对照以缓冲液代替样品。用标准的XOD抑制剂别嘌呤醇作为阳性对照。XOD抑制率 (XOI%) 计算公式如下:XOI% =(1minus;A2/A1)times;100，其中A1和A2分别代表空白组和实验组的尿酸含量。根据剂量-反应曲线的非线性回归方程计算半最大抑制浓度(IC50)。

对不同浓度(0.42 mM和0.21 mM)的黄嘌呤进行酶动力学研究，以确定潜在抑制剂的抑制类型。空白组不含试验化合物平行测定。通过绘制1/V(速度)和1/S(底物)的LB图^[19]。

3 结果分析与讨论

3.1 配体筛选条件的优化

在建立的离心超滤方法的基础上，样品提取液与XOD孵育形成靶-配体配合物。此外，复合物被特定分子量的超滤管保留，相应的，这些化合物的峰值响应在较低的滤液中降低。峰值面积减少的化合物是XOD捕获的配体^[20]。开发的方法的详细示意图如图1所示。潜在的XOD配体通过降低滤液中峰面积筛选出(图2和支撑信息图S1)。进一步，通过对活性组和非活性组的比较，排除了非特异性结合。支持信息图S2显示，活性组的峰面积高于非活性组，说明本方法具有较好的特异性^[21]。考察了该方法的相关因素，并利用高效液相色谱法确定了最佳筛选条件。

活跃的酶

不活跃的酶

图2 枳壳提取物 (1: 芸香柚皮苷，2: 柚皮苷，3: 橙皮苷，4: 新橙皮苷，5 :柚皮素) 的超高效液相色谱图(275 nm)。蓝色实线表示未经过超滤的枳实提取物的超高效液相色谱谱图

XOD浓度首先在0.2 ~ 2.0 U/mL范围内进行研究。很明显，配体的峰面积随着酶浓度的增加而增加，直到0.4 U/mL(图3A)。较高的酶浓度产生了不利的影响。这可能是由于一定浓度的XOD有利于配体与靶标的结合。一旦浓度超过阈值(即0.4 U/mL)，则影响为负。因此，以0.4 U/mL为最佳浓度进行进一步实验。

超滤管的大小是影响目标-配体配合物分离效果的重要因素。因此，对10、30和50 kDa的膜过滤器进行了研究。如图3B所示，10 kDa的超滤管分离性能优于其他的，获得的配体数量最多。很可能在分离过程中，XOD-抑制剂复合物的保留主要发生在10 kda过滤器中。因此，采用10 kda滤镜作为最优尺寸。

孵育时间是影响配体结合量的另一个关键参数，我们将孵育时间从15 分钟变化到60分钟进行测试。从图3C可以看出，30 分钟足够酶与配体充分结合。过多的孵育时间可能导致较低的结合程度。这是由于长时间的孵育会导致XOD活性的降低^[22]。在孵育60 min时，对筛选的配体的反应有轻微的增加，但不是极显著的增加。此外，没有考虑过长潜伏期。如果没有，则超滤法不具备快速筛选的优势^[23]。因此，我们选择30 min的孵育时间为最佳条件。

最终确定最佳生物亲和超滤条件为0.4 U/mL XOD、10 kDa超滤装置、孵育30 min。

图3 XOD浓度对(A)超滤滤器尺寸、(B)孵育时间、(C)配体与X

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