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摘 要

心血管疾病经常出现的临床表现是心律失常，其中尤其是心室颤动、室性心动过速等这些尤其严重的心律失常疾病，原本的心脏疾病不光会越来越恶化，还会导致更严重的心源性猝死^[1]。

研究得出，心肌动作电位复极化过程中，快速延迟整流钾电流(rapidly activating component of delayed rectifier potassium current,IKr)发挥着重要的作用。心脏快速延迟整流钾通道的α亚基是由HERG基因编码, HERG基因突变从而引发遗传性长QT间期综合征(longQTsyndrome, LQTS),而且IKr/HERG通道是能引起心脏QT间期延长药物的作用靶点,也有化学构成不相同的少许药物也会阻碍该IKr/HERG通道,从而引起QT间期延长, 甚至会成为获得性心律失常更严重的情况^[2]。

关键词：心律失常；药物；钾通道

Herg-293t establish a stable cell line membrane potential assay

Abstract

Arrhythmia is a common complication of cardiovascular diseases and a risk factor for human health. Especially，ventricular tachycardia and ventricular fibrillation may not only exacerbate original heart diseases，but also cause cardiac sudden death which has been an important death reason in China ^[1] . Study shows rapidly activating component of delayed rectifier potassium current(IKr) plays a key role in the repolarization phase of cardiac action potential. Human ether-a-go-go-related gene(HERG)encodes the α subun it of this potassium channel. Mutations of HERG gene induce genetic long QTsyndrome(LQTS). Furthermore, IKr/HERG is the target of some drugs which may cause cardiac QT Interval prolongation. Some other drugs with different chemical structures also may block the channel and prolong QT interval,which even developed into acquired arrhythmias^[2].

Keyword：Arrhythmia；medicine；potassium channels

目 录

摘 要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 前言 1

1.1引言 1

1.1.1 hERG 1

1.1.2电压敏感染料 1

1.1.3细胞系与稳定细胞系 1

1.1.4 FLIPR膜电位检测法 2

1.2选题背景与意义 2

1.3课题关键问题及难点 3

1.4课题设计 3

第二章 hERG-293t细胞的构建 4

2.1提取hERG质粒 4

2.1.1实验耗材与仪器 4

2.1.2试剂的配制 4

2.1.3实验步骤 5

2.1.4实验结果 6

2.2复苏293t细胞及扩大培养冻存 7

2.2.1实验耗材与仪器 7

2.2.2试剂的配制 7

2.2.3实验步骤 7

2.3转染 8

2.3.1实验耗材与仪器 8

2.3.2实验步骤 9

第三章 hERG-293t稳定细胞系的构建 10

3.1筛选hERG-293t细胞，形成混合克隆 10

3.1.1实验耗材与仪器 10

3.1.2实验步骤 10

3.2挑混合克隆 11

3.2.1实验耗材与仪器 11

3.2.2实验步骤 12

3.3扩大培养及铺板 12

3.3.1实验耗材与仪器 12

3.3.2实验步骤 13

3.4信号检测及FLIPR实验条件优化 13

3.4.1实验耗材与仪器 13

3.4.2实验步骤 14

3.5有限稀释进行单克隆筛选 15

3.5.1实验耗材与仪器 15

3.5.2实验步骤 15

3.6单克隆信号检测及扩大培养 18

3.6.1实验耗材与仪器 18

3.6.2实验步骤 19

3.7化合物检测 19

3.7.1实验耗材与仪器 19

3.7.2实验步骤 20

第四章 结果与讨论 22

4.1 FLIPR数据图 22

4.2讨论 23

4.3 hERG离子通道与药物安全性 23

致 谢 25

参考文献 26

第一章 前言

1.1引言

1.1.1 hERG

人的心室和心肌细胞钾通道，这是由herg编码的钾通道。当三相为复极时期时心肌细胞动作电位的重要的外向k 电流是其herg通道编码的IKr, 它在心脏动作电位复极化过程当中中有着重要的功能。另外,作为抗心律失常药物第三类药物的靶点的Kr/HERG通道, 当使用某些药物时, 会致使产生长QT 间期综合征,继而发生尖端扭转性室性心动加速（TDP），甚至最终导致猝死^[3]。因此,药物经过阻挡HERG通道发生心律失常这个不良反应已经成为新药物研发过程中一个务必要考虑且严格排查心脏毒性的重要问题。药药物从进行研究发现到进行上市的整个过程需要花相当长的时间， 其中有许许多多的化合物因其本身的性质不符合只能无奈被迫中止开发，因为药物进行吸收方面，它在人体内作用的分布，消化代谢的方式，排泄及心脏毒性安全性等各个方面的问题, 给制药企业造成巨大的经济亏损。目前有许多公司运用虚拟ADMET预测和高通量筛选的方法以降低药物研发后期所具有的风险。具有HERG 阻碍活性的部分药物,这些药物其化学结构多种多样, 如能借助计算机模拟技术对新化学实体进行有效的预测和筛选来看是否具有致心律失常的不良反应，这项技术将为新药的设计和研究中防止药物不良反应产生心律失常起有效的指导作用^[4] 。

1.1.2电压敏感染料

被称作为光学或分子探针的电压敏感染料，它们可以随部分电场的转变而转变染料本身的荧光特征或者吸光特征，而这种变化和膜电位变化的电极记录有一个线性关系。它们可以随部分电场的转变而转变染料本身的荧光特征或者吸光特征，而这种变化和膜电位变化的电极记录有一个线性关系。

电压敏感染料因为其本身所具备的敏感性和特异性，所以对其不相同的钻研目标能够发生差别的染色效果，于是试验前必须要按照所筹备的原料进行染料的挑选，染料的选择和使用应考虑以下几点：（1）染料的内化。（2）光照强度的相对变化率。（3）染料的毒性及副作用。应当尽量选择毒副作用比较小的染料，而且要注重把持染料的浓度和曝光期间在不影响体系信噪比的情况下^[5]。

1.1.3细胞系与稳定细胞系

细胞系便是指从原代细胞（将直接提取动物组织的细胞接种于生长培养基内）经过不断的消化传代培养而获得的一群具有均一性的细胞，这群细胞可以长期进行连续消化传代培养。据细胞系在体外可以继续传代培养这种情况，细胞系可以分为无限细胞系和有限细胞系这2种类型。经过选取或克隆培养，从原代细胞中或细胞系中得到细胞株，而这些细胞株是

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