文 献 综 述

节杆菌(Arthrobacter)在19世纪初首次从土壤中分离得到[l]，并且是土壤中最常分离到的土著性好氧微生物[2一5]。由于这一类细菌在形态学类似于来源于动物的棒杆菌，最初将其归属于棒杆菌属(Corynebacterium) [6]。但是现代系统分析表明节杆菌的成员在分类上应隶属于放线菌微球菌科(Micrococcaceae) [6].节杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属同属于棒状杆菌群 (Coryneform group)。节杆菌最典型的特征就是细胞在生长循环过程中产生显著的形态变化。早期培养物的细胞呈革兰氏阴性的不规则细杆状，部分杆菌按一定角度排列，而在停止期培养物中，细胞则呈革兰氏阳性的球形，当转接到新鲜培养基中，这些球状细胞又会产生分支，形成新的不规则杆状，如此循环往复。有关这种独特的生长循环模式的分子机理仍然有待研究。根据Bergey手册，该属的其他特征有:革兰氏阳性，不抗酸，不产抱子，接触酶呈阳性，严格好氧，化能异养型，细胞壁肚聚糖以赖氨酸作为双胺酸，含有枝状细胞脂肪酸，具有高G C含量(DNA的G C克分子含量在60%至72%之间)，最适生长温度在20℃到30℃之间。截至撰写此论文时，节杆菌属现在主要包括74个种，例如球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)、简单节杆菌(A.simplex)、金黄色节杆菌(A.aurescens)、嗜尼古丁节杆菌(A.nicotinovorans)、成晶节杆菌(A.crystallopoietes)等。其中球形节杆菌是模式种。节杆菌广泛存在于自然环境中，其成员是土壤中的优势菌群，有时是好氧菌总数中最多的单组细菌[6]。节杆菌既存在于普通土壤中，又可以生存于极端环境中，例如南极海冰、金属污染的地区、化学污染地区以及放射性环境[7一12]。近年来有报道节杆菌有条件致病性或可从人体标本中分离得到[13]。

启动子是基因表达调控的重要顺式元件, 也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体, 表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用, 此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术, 像I-PCR、P-PCR、SSP-PCR、YADE、TAIL-PCR等, 为克隆启动子提供了更可靠, 更合理的方法。

在基因工程技术蓬勃发展的今天,我们要想得到大量纯化的目的蛋白质产物,就需要构建一种能够高水平表达异源蛋白质的表达载体。而良好的表达载体的选择要考虑到多方面的因素。启动子对外源基因的表达水平影响很大,是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子与受体细胞之间的合理匹配对异源基因在宿主细胞中的表达起着重要的作用。要使克隆的基因能够在寄主细胞中表达,其编码结构应该处于寄主启动子的有效控制之下。同时,出于高水平表达的要求,这种启动子最好是强启动子,并具有良好的调节控制系统。因此,表达载体的构建,除了要具备克隆载体的一般要求之外,最要紧的一点,它还必须带有能够控制外源插入的DNA 片段进行有效转录和转译的DNA 序列,即启动子结构。弄清启动子的分子本质才有可能找到提高克隆基因表达效率的有效途径。

目前,在表达载体上应用最广泛的大肠杆菌天然启动子有四种,即Plac 、Ptrp 、Pl 和PrecA 。酵母菌可控性启动子表达系统有半乳糖启动子( gal) 、酸性磷酸酶启动子( pho) 等。为了获得更强的启动子,人们还利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子以满足不同外源基因的表达要求。有实验表明[14 ] ,用杂合启动子可以提高基因的表达效率。

利用启动子探针质粒载体筛选启动子是一种常用的方法。它是利用缺失启动子的产物易检测的报告基因,构建启动子探针质粒载体来克隆有启动功能的DNA 片段。其一般程序是:先选用一种适当的核酸内切限制酶,消化切割染色体DNA ;接着将切割产生的DNA 限制片段群体与一种无启动子的质粒载体重组,并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置;随后再把重组混合物转化给寄主细胞,构成质粒载体基因文库,并检测报告基因的表达活性。Rachael LN 等[15 ]在大肠杆菌中以四环素抗性基因为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B ,并用它克隆了一些原核和真核启动子片段。其后,Donna MW 等[16 ]以氯霉素抗性基因为报告基因,Mark MZ 等[17 ]以邻苯二酚双加氧酶基因为报告基因,在枯草杆菌中构建了启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段,李奉锡以此探针质粒克隆了一些噬菌体T5 启动子片段[18 ] 。Scopione RC 等[19]以真菌葡糖淀粉酶基因为报告基因,Sidhu RC 等[20 ]以酸性磷酸酯酶基因为报告基因,Fordor I 等[21 ]以大肠杆菌L acZ 为报告基因构建了酵母启动子探针质粒并克隆得到了一些启动子片段。Luo XM 等[22 ] 在黑曲霉中以潮霉素B ( Hy) 磷酸转移酶基因 ( hph ) 为报告基因构建启动子探针质粒pLX2A ,并克隆得到了一个高效启动子。金红、王以光[23 ]利用启动子探针质粒载体p IJ486 从麦迪霉素产生菌总DNA 中克隆得到了一段具有启动功能的DNA 片段,并分析了插入片段在两个不同方向上的启动能力。

基因表达的最终产物是RNA 和蛋白质,这两大类物质及其次级产物维持着整个生命的有序活动。任何基因表达调控程序上的缺陷或紊乱,均会对生物体造成严重后果。因此,基因表达调控的机理是分子生物学研究的热点和前沿。蛋白质编码基因的表达需要转录和翻译两大环节,每个环节都存在着不同的基因表达调控位点。不管是原核生物还是真核生物,在基因表达调控的细节上尽管差异很大,但两者的调控模式却具有惊人的相似性和可比性#8212;#8212;#8212;转录环节是最主要的调控位点。而启动子的调控在转录环节中又占有十分重要的地位。因此,研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义。

启动子是基因表达调控的重要顺式元件, 也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。

启动子的克隆对于构建基因工程载体, 表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,