摘 要

目的：用不同分子量的MPEG-PLGA载体材料制备负载白藜芦醇的纳米粒，然后进行白藜芦醇载药纳米粒的表征。方法：以溶剂蒸发法制备负载白藜芦醇的MPEG-PLGA纳米粒。观察纳米粒的形态及粒径分布，测定白藜芦醇纳米粒的粒径大小、电位、包封率、载药量，并且进行白藜芦醇纳米粒的体外释放实验。研究结果表明:通过溶剂蒸发法制备的白藜芦醇纳米粒呈球形，用不同分子量的MPEG-PLGA制备的白藜芦醇纳米粒的粒径均在100nm以下，纳米粒的粒径分布均匀。其中用分子量为2000/5000的MPEG-PLGA制备的白藜芦醇纳米粒的包封率和载药量最好分别为87.51%和10.50%。白藜芦醇纳米粒的体外释放满足Higuchi方程，白藜芦醇纳米粒的体外释放实验表明我们制备的白藜芦醇纳米粒拥有缓释的效果。结论：采用不同分子量MPEG-PLGA载体制备的白藜芦醇纳米粒拥有缓释效果，拥有比较好的应用前景。

关键词：白藜芦醇；纳米粒；MPEG-PLGA;

Abstract

Objective: To prepare resveratrol drug-loaded nanoparticles with different molecular weights of MPEG-PLGA, and to detect the characteristics of the drug-loaded nanoparticles. Preparation method: preparing resveratrol-loaded MPEG-PLGA nanoparticles by emulsion solvent evaporation method, observing the morphology and particle size distribution of the nanoparticles, detecting the particle size, potential, encapsulation efficiency and drug loading of the nanoparticles, and conducting In vitro release experiments. The results showed that resveratrol nanoparticles prepared by emulsion solvent evaporation method were spherical, and the particle sizes of resveratrol nanoparticles prepared with different molecular weight MPEG-PLGA were below 100 nm, and the particle size was uniformly distributed. The entrapment efficiency of resveratrol nanoparticles prepared with MPEG-PLGA with a molecular weight of 2000/5000 reached 87.51%, and the drug loading of resveratrol nanoparticles prepared with MPEG-PLGA with a molecular weight of 2000/5000 was up to10.50%. In vitro release of nanoparticles consistent with the Higuchi equation, and in vitro release experiments show that the resveratrol nanoparticles have a sustained release property. Conclusion: the resveratrol nanoparticles prepared by different molecular weight MPEG-PLGA carriers have the characteristics of sustained release and have a good application prospect.

Key Words: resveratrol; nanoparticle; MPEG-PLGA

目 录

摘要 I

Abstract II

第1章绪论 1

1.1前言 1

1.1.1白藜芦醇的性质 1

1.1.2白藜芦醇药理作用 1

1.1.3白藜芦醇的应用现状及其存在的问题 2

1.1.4白藜芦醇的研究现状 3

1.1.5 MPEG-PLGA载体的性质与功能 3

1.1.6 MPEG-PLGA作为药物载体的应用 4

1.2纳米载药系统 4

1.2.1纳米载药系统概述 4

1.2.2纳米载药系统的制备方法 5

1.3研究课题的提出 5

1.3.1研究背景目的及意义 5

1.3.2主要研究内容 6

1.3.3课题创新点 6

第二章白藜芦醇纳米粒的制备及表征 7

2.1实验仪器与材料 7

2.1.1主要实验仪器 7

2.1.2主要实验材料 7

2.2白藜芦醇纳米粒的制备 9

2.3纳米粒的表征 9

2.3.1白藜芦醇标准曲线的绘制 9

2.3.2纳米粒的载药量和包封率的考察 10

2.3.3纳米粒的粒径 Zeta电位 和形貌的观察 10

2.3.4纳米粒的释药 11

2.4实验结果和讨论 12

2.4.1负载有白藜芦醇的MPEG-PLGA纳米粒的制备 12

2.4.2白藜芦醇标准曲线的绘制 14

2.4.3纳米粒的粒径、Zeta电位和形貌的观察 15

2.4.4纳米粒的体外释放实验 18

第三章 结论 21

参考文献 22

致谢 24

第1章绪论

1.1前言

1.1.1白藜芦醇的性质

白藜芦醇无味、不易溶于水，是一种不属于黄酮类的具有多个酚羟基的多酚类化合物，又被人们称为芪三酚。白藜芦醇的化学式是C14H12O3，相对分子质量为228.25。白藜芦醇的外观通常为灰色或者白色而且是粉末状态，白藜芦醇在乙醚、乙醇、丙酮等有机溶剂中的溶解度良好，其中在丙酮中的溶解效果是最好的。并且由于白藜芦醇中含有多个酚羟基因此白藜芦醇可以和三氯化铁溶液发生反应。另外白藜芦醇遇到氨气水溶液等碱性溶液会变成红色，遇到溶解有醋酸镁的甲醇溶液会变成粉红色。白藜芦醇不稳定因此需要保存在温度低和不能被阳光照射的条件下，另外白藜芦醇在碱性条件下也不稳定。白藜芦醇最初被发现是因为它是葡萄属植物的一种抗逆物质植物抗毒素^[1]，20世纪四十年代初白藜芦醇第一次被提取出来，将它提取出来的是一个叫Takaoka的日本人，这个日本人从毛叶藜芦的根部提取出来了白藜芦醇。自然界中的白藜芦醇主要来源于花生^[2]、葡萄（红葡萄酒）、桑葚等植物，人们发现葡萄中的白藜芦醇含量最高的地方是葡萄皮。人们发现白藜芦醇在自然界的存在形式为白藜芦醇和白藜芦醇糖苷两种，而且人们研究发现白藜芦醇及白藜芦醇糖苷的化学结构还都分别存在顺式和反式两种形式。并且人们发现白藜芦醇苷会在人体的肠道中含有的糖苷酶的作用下分解放出白藜芦醇。白藜芦醇在自然界的植物体中主要是以反式的情况存在，人们研究发现反式白藜芦醇的生理活性强于顺式白藜芦醇的生理活性。并且由于白藜芦醇在水中的溶解度很差，所以将白藜芦醇做成普通制剂的意义不大，因为它在人体内的生物利用度不高，口服吸收后参与血液循环的白藜芦醇很少，因此难以在人体内发挥其药理作用^{[3, 4]}。

1.1.2白藜芦醇药理作用

白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，人们研究发现白藜芦醇不仅拥有降低血液粘稠度，抑制血小板的凝结和血管舒张，保持血液的畅通^[5]的作用，还能够预防癌症的发生及发展^[6]的作用。另外人们研究发现白藜芦醇还可以抗动脉粥样硬化，以及白藜芦醇还可以对冠心病、高血脂的具有比较好的防护作用。研究数据表明白藜芦醇还具有抗衰老的作用，人们对老龄大鼠的研究表明，白藜芦醇在不影响体重和血液指标的情况下口服吸收后，可以通过增强老龄大鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答来增强老龄大鼠的免疫调节和起到保护作用，还可通过调节老龄大鼠体内的谷氨酰半胱氨酸连接酶的含量和谷氨酰半胱酸氨连接酶的活性来表明白藜芦醇可能是通过调节了谷氨酰半胱氨酸连接酶从而调节GSH的含量来发挥其抗衰老的效应^[7] 。研究还表明白藜芦醇可以参与细胞内的信息传导、细胞内的一些复合物的形成、细胞代谢以及细胞的增殖和凋亡的过程，这在预防和治疗癌症方面有比较大的前途 ^{[8, 9]}。同时研究表明白藜芦醇不管在体内还是体外都具有抑制多种肿瘤细胞的增殖的作用，比如宫颈癌细胞、白血病细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞等，值得我们注意的是白藜芦醇最直接的抗肿瘤作用体现在皮肤肿瘤和消化道方面的肿瘤，因为这些部位的组织是可以直接和白藜芦醇相接触的^[10-12]。人们研究还发现由于白藜芦醇的化学结构中具有三个酚羟基，因此它们会在机体里能优先的和自由基结合，从而会降低机体里的自由基的含量，以此达到清除机体里的自由基的作用，所以白藜芦醇还具有拮抗庆大霉素耳毒性的作用 ^[13] ，另外白藜芦醇还有抗病毒^[14]以及防辐射等作用 ^[15] 。

1.1.3白藜芦醇的应用现状及其存在的问题

因为白藜芦醇是一种天然的抗氧剂，对清除自由基、抗氧化方面，拥有许多让人们满意的作用，因此白藜芦醇作为一种天然的保健食品被广泛应用于保健品行业。此外白藜芦醇在化妆品行业的应用也较为广泛，在国际上白藜芦醇也早早被收录到了《国际化妆品原料标准目录》（INCI）,在我们国家白藜芦醇也已被列入到了国家食品药品监督管理总局发布的《国际化妆品原料标准中文名称目录》 中了。即使白藜芦醇在化妆品和天然保健食品方面应用十分广泛但是其缺点也是十分明显，因为白藜芦醇的水溶性很差，白藜芦醇被吸收后大部分的都是随着人体的排泄物被直接排泄出去了，因此参与血液循环的白藜芦醇含量很少，因此白藜芦醇在人体中的利用度低，这是限制白藜芦醇广泛应用的最主要的因素，因此想要将白藜芦醇应用到医药行业，我们就要解决白藜芦醇在水中的溶解性的问题。

1.1.4白藜芦醇的研究现状

由于白藜芦醇的水溶性差，因此白藜芦醇在医药行业的应用并不多，而白藜芦醇的药理作用使得人们对它的关注并没有因为其水溶性差而减少。各个国家的研究人员为了解决白藜芦醇在临床上水溶性差、性质不稳定以及体内生物利用度低的问题，已经研究出了各种各样的剂型。其中白藜芦醇纳米制剂是最受研究人员喜欢的剂型，其中包括白藜芦醇纳米粒、固体脂质体等，下面我就就白藜芦醇纳米制剂的最新研究进展进行一些简单的介绍。

将白藜芦醇制作成相应的纳米制剂可以很大程度上的增强白藜芦醇的治疗效果，Jung K ^[16] 等人的研究课题是负载有白藜芦醇的纳米粒抑制葡萄糖的代谢和体内外肿瘤的生长。根据它们的结果显示白藜芦醇纳米粒对葡萄糖的代谢和肿瘤细胞的生长有比较明显的抑制作用。张蓉蓉^[17]等人使用了他们改进了的Stober法合成了氨基修饰介孔二氧化硅，通过他们发明的反复饱和溶液吸附法将白藜芦醇载入到氨基修饰介孔二氧化硅中制备了氨基修饰的介孔二氧化硅白藜芦醇纳米粒，他们的实验结果告诉我们该白藜芦醇纳米粒可以提高白藜芦醇在水溶液中溶解性从而提高生物利用度。 孔祥珍^[18]等人研究了小麦醇溶蛋白自组装白藜芦醇纳米粒子的性质，他们的实验结果表明制备的白藜芦醇纳米粒可以用来提高白藜芦醇的稳定性。相芳^[19]等人对RGD肽修饰的白藜芦醇纳米粒的制备以及该白藜芦醇纳米粒大肠癌细胞SW620的影响进行了，她们实验制作了通过RGD肽修饰的PEG-PEI纳米载体，然后将该纳米载体与白藜芦醇结合形成纳米粒。她们的试验结果表明她们制备的白藜芦醇纳米粒对大肠癌细胞株SW620的增殖有比较好的抑制作用，可以使细胞凋亡比例升高，使癌症细胞进入S期的比例大量增加，因此她们的研究有着比较好的应用前景。

1.1.5 MPEG-PLGA载体的性质与功能

聚（乳酸羟基乙酸）(PLGA)是由乳酸和乙醇酸通过聚合反应得到的共聚物，是一种较为重要的生物载体材料，具有无毒和跟单甲氧基聚乙二醇(MPEG)具有让人满意的生物相容性等特点，而且聚（乳酸羟基乙酸）和聚乙二醇之间没有免疫原性，并且PLGA和PEG都得到了商业化的量产，来源比较广泛。我们实验所用到的载体是由聚（乳酸羟基乙酸）和单甲氧基聚乙二醇聚合得到的，而且由MPEG-PLGA具有亲水和亲脂两种性质，因此由MPEG和PLGA形成的共聚物目前已经被广泛的被用作药物的载体材料。而且用MPEG-PLGA作为载体有以下几个优点：第一点，MPEG-PLGA载体来源比较广泛价格比较便宜，具备良好的生物相容性，能够生物降解，而且无毒副作用；第二点，该载体的分子量比较大，因此不易被人体吸收，所以该载体没有生物毒性；第三点，MPEG-PLGA载体的释药匀速并且释放比较完全，并且能最大限度的保护蛋白药物的活性^[20]；第四点，MPEG-PLGA载体制备出来的负载有药物的纳米粒拥有缓释特点。

1.1.6 MPEG-PLGA作为药物载体的应用

众所周知MPEG-PLGA载体材料不仅具有良好的生物降解作用和生物相容的特性，而且具有多种生物活性，因而，MPEG-PLGA在新型的纳米给药系统的研究中受到了广大研究人员的关注。比如，有的研究人员在实验中使用了复乳法制得的纳米粒的平均粒径在125.0-208.0nm。程欣等人运用了他们改进过的的超声乳化法制备了Di R-peg-plga纳米囊样品，测得该纳米囊的平均粒径为（507.53±7.87）纳米，并且该纳米囊稳定性好，并且他们制备的纳米囊对大鼠的血细胞没有溶血的作用。她们制得纳米囊体外生物相容性比较好，有可能成为一种安全的能表现出药物在体内的踪迹的载体^[21]。方琴^[22]等人使用了界面沉积法制备了载有紫杉醇的MPEG-PLGA纳米粒。制得的紫杉醇纳米粒的粒径小于120nm，而且紫杉醇纳米粒都带负电荷，比较适合静脉注射。并且与紫杉醇注射液相比，他们制得的紫杉醇纳米粒对肝癌H22的抑制作用更强，因此前景比较广泛。

1.2纳米载药系统

1.2.1纳米载药系统概述

纳米载药系统是指药物被分散、包封或者吸附在聚合物粒子上形成的粒子且该纳米粒粒径在1-1000nm之间的药物输送系统。依据制备的方法不同，可以将它们制成纳米粒或纳米囊这些满足研究要求的纳米载药系统，纳米载药系统所用的载体聚合物通常为天然的或者人工合成的高分子材料。通常载药系统可以使得药物在需要治疗的部位聚集，以达到可以有效治疗该疾病的的药物浓度。纳米载药系统不仅会拥有一些靶向作用，对正常的组织器官无毒或者毒性较弱。而且纳米载药系统能够增加难溶于水的药物的的水溶性提高药物参加血液循环的含量。

依据药物与纳米载体的结合方式的差别，我们通常将纳米载药系统分为两个大类：一类是药物与纳米载体通过共价键偶联的方式结合起来制得纳米载药系统。另一类是药物与纳米载体不是通过非共价键的形式结合，主要通过物理方法制得纳米载药系统。

1.2.2纳米载药系统的制备方法

制备纳米载药系统的关键是制备的纳米粒的粒径满足我们的要求和粒径分布比较均匀纳米粒，从而很大程度上减少纳米粒聚集成团的现象。保证药物的药效、药品的安全性和稳定性是药品制造行业的最低要求，因此制备纳米载药系统时，需要考虑到生产条件、花费以及产量等很多方面的因素。

制备纳米载药系统的方法有很多，根据形成纳米粒的机制的不同将他们分为两大类，一类是以载体材料单体通过聚合反应，载体材料单体在聚合的过程里将我们需要包裹的药物包裹起来，从而形成了纳米粒，一般称作这种方法为聚合法。其中常见的有乳液聚合法、界面聚合法等。因为聚合反应不可能进行的彻彻底底，因此反应得到的纳米粒中常常混合有未反应完全的单体，而且聚合过程中使用的催化剂和表面活性剂等也会混合在纳米粒里，通常这些物质对人体产生一些不好的作用，因此限制了聚合法的广泛应用。另一类就是分散法，由于聚合法的缺陷比较大，因此人们通过分散法制备纳米粒。其中常见的分散法有凝聚分散法、乳化/溶剂扩散法、溶剂蒸发法等。

1.3研究课题的提出

1.3.1研究背景目的及意义

研究人员的对白藜芦醇的药理学研究表明，白藜芦醇具备非常多的药理作用，比如抗癌、抗肿瘤、抗衰老等。但是白藜芦醇在水溶液中的溶解度很低，体外的稳定性也很差以及口服给药吸收进入血液循环的含量也很少，大部分被直接排出了体外，没有发挥其药理作用。因此白藜芦醇的水溶性很差在极大程度上限制了白藜芦醇在临床实验上的应用。研究表明白藜芦醇为亲脂性成分，能够顺利的穿透细胞膜，但是其水溶性很差这就导致了其生物利用度很低，而且白藜芦醇在碱性条件下不稳定，研究人员为了让白藜芦醇在临床上得到更广泛的应用，他们将目光转向了纳米载体。纳米载体具有增加药物在水中的溶解特性以及稳定性的特点，纳米粒的最大特点就是其粒径是纳米级的，因此它们可以增加药物在人体内的循环时间以及提高需要治疗的部位的药物浓度 。因此近年来来纳米给药系统已经成为了提高白藜芦醇广泛应用的研究热点和研究方向。

本论文就白藜芦醇纳米粒的制备以及表征的测定进行研究，采用MPEG-PLGA为纳米载体，通过载体的两亲性将白藜芦醇包裹在里面，形成一个外面亲水里面包裹着药物的纳米粒，以增加白藜芦醇的水溶性，而且负载有白藜芦醇的纳米粒还具有缓释特性。

1.3.2主要研究内容

根据实验目的：白藜芦醇的纳米粒的制备，白藜芦醇纳米粒的表征。本实验分为两个部分

1. 白藜芦醇纳米粒的合成；
2. 白藜芦醇纳米粒的表征包含纳米粒的形态的观察 、粒径及粒度分布测量、包封率、载药量的测量。以及白藜芦醇纳米粒的体外释药的研究。

1.3.3课题创新点

本课题通过将白藜芦醇包载在纳米粒里，可以提高白藜芦醇的水溶性，同时具有缓释作用，达到提高白藜芦醇的生物利用度的目的，该研究方法具有一定的创新性。本实验选取了MPEG-PLGA为载体，依据MPEG-PLGA的亲水性和亲脂性以及无毒、价格低廉的特点制备了绿色安全的纳米材料，这也是本研究的一个亮点。

本实验以MPEG-PLGA亲水性和亲脂性的两种特点为出发点制备了白藜芦醇纳米粒，由于该载体材料具有缓释特点，因此我们制得的白藜芦醇纳米粒也拥有缓释的特点。本实验过程对白藜芦醇纳米粒的制备工艺进行了考察，并对所制得的白藜芦醇纳米粒的纳米粒的形态、纳米粒的粒径及粒度分布、包封率、载药量进行了测量以及进行了白藜芦醇纳米粒的体外释放特性的研究。此项研究主要为了有效的提高白藜芦醇的水溶性以及白藜芦醇纳米粒的缓释。可以很好的提高白藜芦醇生物利用度。

第二章白藜芦醇纳米粒的制备及表征

2.1实验仪器与材料

2.1.1主要实验仪器

实验所用的主要仪器如表2.1所示