摘 要

香青兰（Dracocephalum moldavica L）即维药巴迪然吉布亚，陕西称作野青兰，甘肃称作青兰。香青兰生长于海拔220~1600m的干燥山地、山谷等多石处。我国资源十分丰富，多分布于新疆、吉林等地。香青兰具有疏风清热、利咽止咳和凉肝止血的功效，可用来治疗感冒发热、头痛、咽喉肿痛、咳嗽气喘等疾病。香青兰中主要含有黄酮类及苯丙素类化合物，而黄酮类化合物是香青兰抗氧化、抗动脉粥样硬化以及防治心血管疾病的主要作用成分，也是近年来香青兰化学成分研究的热点。但是目前香青兰生药来源杂乱，且不同产地的香青兰中有效成分差异较大，因此对香青兰质量进行控制十分重要。

本课题旨在运用TLC法和HPLC法为研究方法，以木犀草素为指标研究香青兰药材的质量。本实验分为两个部分，第一部分为TLC法鉴别香青兰药材。第二部分为HPLC法测定香青兰中木犀草素含量。

研究结果表明本课题所建立的TLC法鉴别香青兰药材时，斑点清晰，分离度高，专属性和耐用性良好。本课题所建立的HPLC法测量结果表明木犀草素在2.1μg/ml～21.0μg/ml浓度范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系（R²=0.9993），重复性实验RSD为1.33%,,准确度实验RSD为1.20%。结果表明该实验方法专属性强，线性关系良好，重复性和准确度均满足RSD≤2%的要求。表明该方法可以准确，可靠，合理地鉴别香青兰药材及测定其中木犀草素含量，为检测和控制香青兰药材质量提供方法依据，对提高香青兰质量标准具有重要意义。

关键词：香青兰、木犀草素、薄层色谱、高效液相色谱

Abstract

Dracocephalum moldavica L，a Uygur medicine in the name of Baeiranjiboya, which is known as wild blue orchid in Shanxi and blue orchid in Gansu.DML grow in the dry mountainous areas, valleys and other rocky areas with an elevation of 220~1600m. China has rich resources and is mostly distributed in Xinjiang, Jilin and other places. DML has the effects of dispelling wind, clearing heat, relieving cough, relieving cough, and stopping liver and cooling. It can be used to treat colds, fever, headaches, sore throat, and cough and wheezing. DML mainly contains flavonoids and phenylpropanoid compounds, and flavonoids are anti-oxidation and anti-atherosclerosis. As well as the main components of the prevention and treatment of cardiovascular diseases, it is also a hot topic in the study of the chemical constituents of DML in recent years. However, at present, the source of raw herbs of DML is disorderly, and the active ingredients in different producing regions are different. Therefore, it is very important to control the quality of DML。

This project aims to use the TLC method and HPLC method as the research method, using luteolin as an indicator to study the quality of the medicinal materials of DML.This experiment is divided into two parts. The first part is the identification of medicinal herbs of DML by TLC. The second part is to measure the luteolin content in DML by HPLC.

The results of the study showed that when the TLC method was used to identify the herbs of DML, the spots were clear, the resolution was high, and the specificity and durability were good. The results of HPLC method showed that the concentration of luteolin in the concentration range of 2.1μg/ml~21.0μg/ml showed a good linear relationship (R²=0.9993). The repetitive experiment RSD was 1.33% and the accuracy experiment RSD was 1.20%.The results showed that the experimental method has a good linear relationship, specially strong, the repeatability and accuracy meet the requirements of RSD ≤ 2%. It showed that the method can accurately, reliably and reasonably identify the medicinal materials of DML and its content of luteolin. It provides a method basis for the detection and control of the quality of DML, and has important significance for improving the quality standards of DML.

Key words：Dracocephalum moldavica L，Luteolin，TLC，HPLC

目录

第一章 绪论 1

1香青兰研究概况 1

1.1香青兰的药理药效研究 1

1.1.1降血脂和抗动脉粥样硬化作用 1

1.1.2 对缺血心肌和脑的保护作用 1

1.1.3镇静和催眠作用 2

1.2香青兰临床应用 2

1.3香青兰的化学成分 2

1.3.1挥发油化合物 2

1.3.2黄酮类化合物 3

1.3.3苯丙素类化合物 4

1.3.4三萜类与甾体类化合物 4

1.4不同产地香青兰有效成分含量差异 4

1.5香青兰药材质量标准研究意义 4

2木犀草素研究概况 5

2.1木犀草素药理作用及药效研究 5

2.1.1抗氧化作用 5

2.1.2抑菌作用 5

2.1.3抗炎作用 5

2.1.4抗肿瘤作用 6

2.2木犀草素含量测定 6

2.2.1紫外分光光度法(UV法) 6

2.2.2薄层色谱扫描法(TLC法) 6

2.2.3高效液相色谱法(HPLC法) 6

2.2.4反相高效液相色谱法(RP-HPLC法) 6

2.2.5含量测定法总结 7

2.3木犀草素的分离 7

2.3.1树脂吸附法 7

2.3.2溶剂萃取法 7

2.3.3超声波分离法 7

2.4木犀草素的纯化 8

2.4.1柱色谱法 8

2.4.2结晶法 8

第二章 香青兰质量标准研究 9

1薄层色谱鉴别 9

1.1仪器与材料 9

1.2香青兰药材薄层色谱鉴别方法 10

1.2.1薄层色谱鉴别专属性验证 10

1.2.2薄层色谱鉴别耐用性考察 11

2 高效液相色谱法含量测定 11

2.1仪器与材料 11

2.2木犀草素含量测定方法 13

2.2.1色谱条件与系统适用性试验 13

2.2.2 对照品溶液的制备 13

2.2.3供试品溶液的制备 13

2.2.4专属性实验 13

2.2.5线性关系考察 13

2.2.6重复性试验 14

2.2.7加样回收率试验 15

2.2.8样品的含量测定 15

3 结果与讨论 16

3.1实验结果分析 16

3.2检测波长的选择 17

3.3流动相的选择 17

参考文献 18

附录 21

致谢 23

绪论

1香青兰研究概况

香青兰（Dracocephalum moldavica L），在新疆地区被称作巴迪然吉布亚^[1]，是唇形科青兰属的植物香青兰干燥地上部分，其性质二级干热，具有香味。目前有研究^[2]表明香青兰不仅可以补脑安神，活血化瘀，镇咳止喘，强心利尿，还具有疏风清热和凉肝止血的功效。也正因此香青兰主要用于治疗冠心病、高血脂高血压、寒性感冒、咽喉肿痛、气管炎等疾病。

香青兰的主要产地^[3]位于我国华北、东北、西北等省区，在新疆又以南疆地区和东疆地区栽种培育较多，同时在欧洲等地也有分布。

1.1香青兰的药理药效研究

近些年来，国内外学者对于香青兰的药理及药效的研究非常活跃。大量实验研究表明，香青兰具有多种有益于人体健康的药理作用，可广泛应用于临床治疗。

1.1.1降血脂和抗动脉粥样硬化作用

香青兰对于降低血脂具有良好功效，可以用来治疗冠心病、高血脂高血压等相关疾病。李琼等^[4]以石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇和水为溶剂提取香青兰中化学成分，发现各种香青兰药材提取物均能显著降低生物体内胆固醇、甘油三酯等指标成分水平，并能够有效提升高密度脂蛋白及胆固醇水平。五种提取物中以石油醚为溶剂的提取物药效最佳，研究者认为其药效可能与香青兰中黄酮类活性成分和萜类活性成分有关。谭梦晖等^[5-6]研究发现以石油醚、乙酸乙酯和水为溶剂的香青兰药材提取物都对治疗脂质代谢紊乱等疾病有显著疗效，表明其降血压降血脂的作用机制可能与香青兰中活性成分的抗氧化作用有关联。曹文疆等^[7]通过实验研究发现，香青兰总黄酮抗动脉粥样硬化的作用机制可能为抑制TNF-α（肿瘤坏死因子-α）诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖，从而减轻动脉粥样硬化症状。

1.1.2 对缺血心肌和脑的保护作用

近年来，国内外学者对于香青兰保护缺血心肌的作用机制的研究更为深入。研究表明，香青兰能够有效清除自由基^[8]，并增强自由基清除酶的活性^[9]，保护缺血心肌，修复心脏缺血一再灌注损伤^[10]。田友清等^[11]对于香青兰修复心脏缺血一再灌注损伤的血清药效学指标进行基础研究，并深入考察香青兰对于血流动力学指标的影响。研究表明，香青兰会心脏血液供应和氧气平衡有显著的调节作用，减轻心肌缺血过程中血小板聚集和抗血栓形成的情况。此外，香青兰总黄酮能够激活内皮依赖性NO和PGI₂通路，并对抑制血管平滑肌细胞膜上的钙离子通路，从而发挥多靶点血管舒张作用^[12]。

香青兰总黄酮具有较强的脑保护作用。孙雅煊等^[13]进行实验研究，发现香青兰总黄酮能够有效抑制脑缺血再灌注后的炎症反应，该药效作用机制可能为降低脑组织中的过氧化物酶的活性和髓细胞间黏附分子-l的传达，从而使脑梗死面积减少，发挥较强的脑保护作用。

1.1.3镇静和催眠作用

香青兰具有镇静和催眠的功效。康小龙等^[14]对香青兰有效部位滴丸的药理药效进行研究，发现香青兰有效部位滴丸能够抑制小鼠的自发活动，抑制强度随剂量增加而增强。药效主要表现为香青兰滴丸增加了小鼠在戊巴比妥钠阈剂量给药下的睡眠时间，增强了其抗疲劳能力，增加了其尿量。此研究表明香青兰有效部位滴丸具有镇静、催眠、利尿以及抗疲劳等作用。

1.2香青兰临床应用

李诗国等^[15]将一批由慢性阻塞性肺疾病引起的具有呼吸困难、肺部罗音及水肿的慢性肺源性心脏病患者，分为观察组及对照组，每组各62例，对照组给予该病的常规性综合治疗；观察组在对照组的基础上使用香青兰颗粒对患者进行治疗。 结果表明观察组的总有效率高达93.55％，而对照组的总有效率仅为80.65％，且显效例数差异显著。两组对呼吸困难、肺部罗音、水肿等症状的起效时间(d)分别为3.33±1.47、4.44±2. 08、4.55±2.09和5.77±2.18、6.28±2.35、6.73±2.55(P lt;0.01)；两组治疗呼吸困难、肺部罗音、水肿症状消失时间(d)分别为9.24±2.65、7.38±2.34、7.12±2.05和12.39±3.19、10.79±2.62、10.24±2.64(Plt;0.01)。该实验证明香青兰确有治疗慢性肺源性心脏病的功效。

1.3香青兰的化学成分

香青兰中含有多种天然成分，研究香青兰药材中所含的主要活性成分以及这些成分对于人体的药理作用，对于研究香青兰药理及药效具有重要意义。

1.3.1挥发油化合物

据相关文献报道^[16]，香青兰中挥发性成分主要有香叶醇，橙花醇，柠檬烯，香茅醇，百里香酚，萜烯，倍半萜烯，柠檬醛，棕榈酸，香叶醇乙酸酯，胡萝卜素，α-蒎烯、β-蒎烯、宁烯、冰片烯、萜品醇-4、8-异丙叉二环等。

盛晋华等^[17]对野生与人工种植香青兰中主要挥发油成分进行考察，考察结果表明二者存在差异，野生香青兰挥发油中含桉油精17.676％和紫苏醛15.846％；人工种植I号挥发油中含橙花醇7.971％、橙花醛8.784％、香叶醇12.377％、柑醛 11.685％；人工种植II号挥发油中含橙花醇16.332％、橙花醛 6.659％、香叶醇17.164％、柑醛8.987％。

骆红飞等^[18]对香青兰挥发油的抗菌、抗流感病毒作用进行实验研究，发现香青兰挥发油成分对痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌等具有很好的抑制作用。25、45和90mg/kg剂量组可有效治疗小鼠因感染甲型流感病毒所引起的肺部组织疾病，延长小鼠的存活期并降低其死亡率，表明香青兰挥发油具备抗菌及抗流感病毒作用。

1.3.2黄酮类化合物

至今为止，国内外学者从香青兰药材中共分离提取得到三十多种黄酮类化合物，均为黄酮、黄酮醇及其糖苷类化合物，化合物结构中所连接的糖类均为葡萄糖，木糖及其衍生物，糖类大多位于母核的3位或7位。香青兰中黄酮类成分主要包括芹菜素，金合欢素，木犀草素，玄参黄酮，鼠尾草素，8-羟基-鼠尾草素，异鼠李素，山奈酚，香叶木素，栀子素乙，金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，芹菜素-7-O-B-D-半乳糖苷，槲皮素，木犀草素-7-O-B-D-葡萄糖苷，山奈酚-3-O-葡萄糖苷，田蓟苷等。

有实验研究表明黄酮类化合物是香青兰抗氧化、降血压降血脂、抗动脉粥样硬化等药效作用的主要活性成分。曹文疆等^[7]研究发现，香青兰总黄酮抗动脉粥样硬化作用机制可能为抑制TNF-α诱导的血管平滑肌细胞的增殖。香青兰总黄酮能够激活内皮依赖性NO和PGI₂通路，抑制血管平滑肌细胞膜上的钙离子通路，从而发挥多靶点舒张血管降血压的作用，以保护缺血心肌^[12]。除此之外，香青兰总黄酮还具有较强的脑保护作用。孙雅煊^[13]等研究发现香青兰总黄酮可以有效抑制脑部缺血再灌注后的炎症级联反应，从而使脑梗死面积减少，发挥脑保护作用。杨彩玉等^[19]就香青兰总黄酮对大鼠离体胸主动脉的舒张作用进行实验研究，研究表明香青兰总黄酮具有较强的舒张血管作用。

宋睿等^[20]使用纯度为70％的甲醇溶剂提取香青兰药材，再采用UV法测得香青兰中总黄酮含量为1.90％，采用HPLC法测得刺槐素-7-O-β-D葡萄糖苷含量0.33％。周明明等^[21]采用RP-HPLC法对香青兰水提取物中槲皮素含量进行测定，结果为4.48mg/g。袁勇等^[22]采用HPLC法对香青兰甲醇提取物中田蓟苷的含量进行测定，结果为28.5mg/g。

尤努斯江·吐拉洪等^[23]对香青兰总黄酮超声提取的最佳工艺进行了深入研究，发现当采用乙醇浓度60％、时间50min、温度60％、料液比1：40(g/mL)的方法时，总黄酮得率最高，为1.89％。

1.3.3苯丙素类化合物

香青兰中的苯丙素类化学成分主要包括苯丙酸、香豆素和木脂素类化合物，而其中含量最高的是迷迭香酸(248 mg/g) 和绿原酸(41.5 mg/g)^[24]。王晓俭等^[25]采用RP—HPLC法测定香青兰甲醇提取物中阿魏酸含量5.47 mg/g。有国外学者实验研究^[26]表明苯丙酸类化学成分具有较好的抗氧化作用，是香青兰发挥抗氧化作用的重要成分之一。

1.3.4三萜类与甾体类化合物

从香青兰中分离获得的的三萜类化合物大多为五环三萜型化合物，包括乌苏烷型、齐墩果烷型等。布海力且木· 阿里等^[27]采用RP- HPLC法对香青兰甲醇提取物中齐墩果酸和熊果酸的含量进行测定，结果分别为1.7mg/g和1.3mg/g。田树革等^[28]采用大孔吸附树脂-比色法对香青兰中总三萜酸的含量进行测定，为1.49％。

1.4不同产地香青兰有效成分含量差异

于宁等^[29]对吉木萨尔、于田、墨玉、阜康四个地区所产香青兰中木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（I）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（II）、迷迭香酸、香叶木素-7-O-葡萄糖醛酸苷（III）、田蓟苷和刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷（IV）六种有效成分含量进行测定。经实验研究表明，不同产地香青兰药材中 I、II、迷迭香酸、III、田蓟苷和 IV 的含量差异比较大。吉木萨尔所产的香青兰药材中 6 种指标成分的量最高，墨玉所产的香青兰药材中 I、II、田蓟苷和 IV 的量最低，于田所产的香青兰药材中迷迭香酸、III的量最低。

1. 5香青兰药材质量标准研究意义

迄今为止，国内学者对香青兰的研究主要集中于对其药理药效的实验研究, 而对于药材质量控制的报道相对较少。不同产地的香青兰中有效成分差异较大，而药材质量关系到药物的安全有效、质量可控, 但是目前香青兰生药绝大多数来源于无序与混乱的野生药源，难以确保药材质量的稳定性和有效性。而现在香青兰药材的质量标准仅有性状鉴别项，而对于香青兰中活性成分的鉴别和含量测定分析比较少，并且只能采用香青兰对照药材的TLC鉴别方法作为质量标准对香青兰各类制剂的质量进行分析研究，均不能有效检测和控制香青兰药材及其制剂的质量。因此通过实验建立一个合理，准确，科学的香青兰薄层色谱鉴别方法以及高效液相色谱含测方法以提高香青兰药材质量标准，具有十分重要的意义。

2木犀草素研究概况

香青兰中含有三十余种黄酮类化合物，黄酮类化合物成分是香青兰发挥药效作用的最主要成分。木犀草素是天然黄酮类化合物中具有代表性的一种活性成分，属于弱酸性四羟基黄酮类化合物，能够溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，也能够溶于碱性溶液中，微溶于热水，并可以溶于浓硫酸形成暗红色锌盐。

木犀草素在自然界有广泛分布^[30]，存在于各类蔬菜和水果中，如芹菜、胡萝卜、菊花、洋白菜等。木犀草素常以糖基化形式^[31]存在于自然界中。木犀草素有很强的抗氧化作用，利用其抗氧化性，可以用来抑制含油食品的哈败。此外，相关临床实验也表明木犀草素具有抑菌、抗炎、抗肿瘤以及降低血脂血压的作用。

2.1木犀草素药理作用及药效研究

2.1.1抗氧化作用

自由基是自然界中十分常见的具有不对称电子的原子与基团。其与生物体内细胞老化、癌症的引起、免疫功能的下降、糖尿病等许多生命现象及疾病存在着密切关联。研究^[32-33]表明木犀草素能够清除或抑制自由基，其作用机理是通过酚羟基与自由基反应生成相对稳定的半醌自由基，使得自由基链式反应停止，从而能够有效清除自由基或抑制自由基，发挥抗氧化作用。阎高峰等^[34]采用TBA快速测定法对木犀草素抗氧化活性进行研究，结果表明当木犀草素在芝麻油和猪油中浓度达0.02%时其抗氧化效果与BHT（抗氧剂264）相接近，且在猪油中抗氧化能力强于茶多酚。

2.1.2抑菌作用

木犀草素的抑菌作用表现在其能够抑制葡萄球菌、枯草杆菌以及大肠杆菌的生长。同时，它对于卡他菌、白色念珠菌、变形杆菌的生长也有抑制作用。王秋安^[35]将木犀草素作为食品防腐剂，发现其具有防止食品腐败变质，保持食品原有品质及营养价值，延长食物保质期等用途。

2.1.3抗炎作用

木犀草素具有较强的抗炎作用。木犀草素的抗炎活性表现在许多方面，王继双等^[36]对其中一种抗炎机制进行实验研究，表明木犀草素的抗炎作用主要通过降低炎症因子转录调节因子的活性，从而减少促炎细胞因子和炎症介质的产生，发挥较强的抗炎作用。除此之外，木犀草素还有多种抗炎作用机制，本文不再赘述。

2.1.4抗肿瘤作用

木犀草素具有抗肿瘤的作用。木犀草素抗肿瘤功效主要表现在三个方面。第一，木犀草素能够抑制肿瘤细胞增殖。第二，木犀草素可以诱导肿瘤细胞凋亡。第三，作为抗癌药物的增敏剂抑制肿瘤生长。木犀草素可以有效降低结肠癌、直肠癌及卵巢癌的发病率,是一种很有前途的抗肿瘤化合物。

2.2木犀草素含量测定

测定药用植物中有效成分的方法有很多种，例如紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、反向高效液相色谱法等。

2.2.1紫外分光光度法(UV法)

紫外分光光度法仪器简单，操作十分方便，灵敏度较高，有一定选择性，应用范围广泛，但准确度相对较低。张蔚玲等^[37]采用紫外分光光度法在353nm波长处对木犀草素-3-葡萄糖苷进行了含量测定，方法简单易行，测定效果良好。

2.2.2薄层色谱扫描法(TLC法)

薄层色谱扫描法优点在于斑点显色，可提供更多信息，可结合荧光检视，薄层板可保存，可收集斑点进行结构分析，但是含测结果的准确度，稳定性，精密度都相对较差。沈雁书等^[38]采用薄层扫描法来定量测定不同产地、不同批号、不同品种菊花中的木犀草素含量，其结果对于检测和控制不同产地和品种的菊花的质量，种植和采购菊花以及建立菊花质量标准有重要意义。

2.2.3高效液相色谱法(HPLC法)

高效液相色谱法分离效率好，选择性相对较高，灵敏度高，应用范围广且测定结果准确，因此被广泛用作含量测定的主要方法手段。胡碧波等^[39]采用HPLC法对不同采收时期杭白菊中木犀草素及其糖苷类化合物的含量进行了测定,测定效果较好。

2.2.4反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)

反相高效液相色谱法操作简单、准确度较高，检测灵敏，应用范围广，适用于分离非极性，极性或离子型化合物。王天勇^[40]首次采用反相高效液相色谱法对狼把草中的木犀草素、槲皮素和芹黄素进行分离及含量测定，并建立了狼把草中有效成分分离和测定的方法。

2.2.5含量测定法总结

由于实验条件限制，本实验可供选择的方法包括UV法和HPLC法。两种方法均操作方便，应用广泛，但UV法准确度与HPLC法相比较差。因此本实验采用高效液相色谱法，该法分离效率好，选择性相对较高，灵敏度高，应用范围广且测量结果准确。

2.3木犀草素的分离

目前，分离木犀草素等黄酮类活性成分的常用方法包括树脂吸附法、溶剂萃取法、超声波分离法等。本实验采用的方法是超声波分离法，该方法分离效果好且简便可行。

2.3.1树脂吸附法

吸附树脂用途广泛，不仅可用于天然产物的分离精制，也可用于废水净化以及糖液脱色等。常用的吸附树脂包括聚酰胺、聚苯乙烯树脂、大孔吸附树脂和聚苯烯酸树脂等。树脂的吸附原理由吸附剂类型决定，吸附剂不同，吸附原理也不同。吸附原理包括静电吸引、疏水效应、共价键等。，树脂吸附法具有生产生产周期较短，成本较低、选择性好、再生处理方便等优点。赵骏课题组^[41]对D-4020、D-101、NKA、AB－8这4种吸附树脂对含有黄酮苷的荷叶萃取液的分离效果进行研究，同时对比研究了这4种树脂的吸附能力与解吸附能力。研究表明最佳工艺方案为: 采用洗脱液醇与水（2∶3）为洗脱液、AB-8树脂为吸附剂，此时分离得到的产品纯度最高，可达60%。

2.3.2溶剂萃取法

溶剂萃取法是从天然产物中分离得到目标产物的重要方法手段，具有富集因子大、操作可连续化适合大规模生产，对热敏物质破坏少等特点。其基本原理是根据两种互不相溶的试剂中目标组分的分配系数的差异，将其从一种溶剂中转移至另一种溶剂中，经反复多次萃取达到将目标组分与其他成分分离的目的。

2.3.3超声波分离法

超声波分离法也可用于从天然产物中提取活性成分，相对于传统的加热回流法与索氏提取法，超声波分离提取法具有很多优点，比如提取效率高、提取时间短、提取温度低、适用性广等。其原理主要是利用超声空化作用破坏动植物细胞膜，从而增加溶质扩散。然而，其强烈的振动容易产生噪声污染影响周围环境，并且在大规模提取时效果相对较差，因此超声波分离通常用作辅助提取手段以增强提取效果。

2.4木犀草素的纯化

2.4.1柱色谱法

柱色谱法纯化过程常使用的吸附剂或载体包括硅胶、聚酰胺、纤维素粉和大孔树脂等，硅胶是柱色谱纯化过程中较传统的吸附剂，而大孔树脂以及聚酰胺是柱色谱纯化过程中较为理想的吸附剂。