文 献 综 述

1.1 漆酶在染料废水处理中的研究背景

漆酶^[1]是一种含铜的多酚氧化酶，能催化酚类化合物的氧化，是一组有广阔应用领域的酶类，漆酶广泛存在于白腐菌中，漆酶对底物的专一性不高，能氧化大范围的化合物。近年来，漆酶在环境污染治理、生物除污等方面有广泛的应用。在印染和造纸等工业过程中排放的含有大量染料的废水，已成为当今主要的环境问题之一，采用通常的活性污泥方法处理该类废水很难达到预期目的，而漆酶对纺织染料的脱色、降解效果明显^[2]。

据最新资料统计^[3]，我国每年印染废水排放量占总工业废水排放量的35％，己成为危害最大的难以治理的重要污染源。大部分合成染料都难以被微生物降解，而所有染料中约50％均含氮类染料。这些化合物通常被用作纺织、食品业、塑胶和生物医学的着色剂。每年的商用染料全世界达7#215;105t，种类达10000种，其中10％-5％的染料都以工业污水的形式排放出来。有色污水直接被释放到环境中，许多染料在厌氧环境下会转化为有毒物质或致癌物质，许多国家都颁布了严厉的法规来限制工业染料污水的排放。由于染料自身特殊的化学结构，往往不能有效地被凝结、臭氧、活性炭等单一技术处理。由于绿色环保的运行成本低，生物处理法可获得较高的脱色率，成为当前印染废水脱色研究的热点。近年来，大部分研究都集中在白腐真菌对染料的降解，而对其它类真菌的研究较少。

本课题主要是对漆酶在染料废水处理中应用的研究。研究内容包括：①漆酶的发酵制备及分离；②典型染料废水的色度分析；③漆酶用于染料废水脱色的反应条件。

1.2 漆酶的发酵制备及分离方法

1.2.1漆酶的发酵制备

1.2．1.1菌种

彩绒革盖菌(杂色云芝)^[4],保存于PDA培养基（土豆20%、葡萄糖2%、琼脂2%）上，4℃条件备用。

1.2.1.2液体培养基

葡萄糖20g/L；蛋白胨3g/L；磷酸二氢甲1g/L；十二水磷酸氢二钠0.2g/L；七水硫酸镁0.5g/L；微量元素1ml/L，pH自然（约4.7）。

1.2.1.3种子液制备

在液体培养基接入PDA固体培养基上培养7～9d的菌种若干片(d=60mm)，25℃下静止培养至菌丝悬浮于整个瓶底（约5～6d）即可使用。

1.2.1.4漆酶的制备

按20%装液量装入指定培养基，121℃下灭菌20min，接种时将种子液取出倒入含玻璃珠的无菌容器中振荡，使成均匀菌丝液，每瓶中接入2%菌丝液。于25℃、160rpm条件下培养，每次实验均同时做平行对照，实验过程中定时取样测定酶活、pH等数据。

1.2.2漆酶的分离方法

1.2.2.1硫酸铵沉淀^[5]

蛋白质分离纯化的起始步骤一般是先通过沉淀、超滤等方法处理大体积的溶液样品，将样品浓缩的同时还可去除部分杂蛋白。沉淀法中还可用有机溶剂如丙酮等作为沉淀剂，但更常用的还是硫酸铵盐。硫酸铵盐最大的特点是对蛋白质的损伤较小，是一种温和的沉淀剂。此方法为：先用60%饱和度的硫酸铵除去杂蛋白，收集60%～80%硫酸铵饱和度的沉淀，用少量10mmol/L pH 7.0的磷酸氢二纳缓冲液溶解沉淀，透析过夜后，用聚乙二醇20000浓缩，得到粗酶液。

1.2.2.2阴离子交换柱层析^[5]

通过柱层析法获得目的蛋白是进一步分离纯化蛋白的必要手段，离子交换柱层析是根据蛋白质在一定pH条件下静电荷差异而将彼此分开的方法。阴离子交换柱层析主要用于相对低等电点蛋白质样品的分离。根据有关漆酶文献的了解，漆酶等电点大多在酸性范围，因此对漆酶的分离只能采用阴离子交换柱。

1.2.2.3 Sephadex G-75柱层析^[5]

分子筛是根据分子量大小将不同蛋白质分开，已有结果显示真菌漆酶分子量主要在50000～70000 Da范围内，除个别有二聚体的分子量达10万以上，Sephadex G-75分子筛柱层析正适合分子量在3000～80000 Da的蛋白质。

1.2.2.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳^[5]

SDS即十二烷基硫酸钠，是阴离子表面活性剂，能断裂分子间与分子内的氢键，破坏蛋白质的二级结构和三级结构，能以一定的比例和蛋白质结合。当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。可以用已知蛋白质的分子量来校正电泳迁移率，因此可估测未知蛋白质的分子量。

1.3漆酶的酶活测定方法^[6]

1.3.1漆酶的定性分析法

1.3.1.1漆酶酶活的平板分析

用这种方法可以快速检测胞外培养液中是否含有漆酶，Souza等以ABTS为第底物，甘氨酸-HCl为缓冲液(pH=3．0)，分别将胞外液、煮沸的胞外液及漆酶溶液放入无菌的琼脂糖培养基的小坑中，用煮沸的胞外液及漆酶溶液对底物的反应分别作为正、负对照，如果胞外液所在的小坑边缘有类似漆酶溶液所在小坑边缘的那种强烈的蓝绿色，则此胞外液呈漆酶的阳性反应，表示有漆酶。

1.3.1.2漆酶的活性凝胶电泳测定

付时雨等采用垂直板PAGE凝胶电泳法，其中分离胶质量分数为10％，pH值为8．7，浓缩胶质量分数为2．5％，pH值为6．7。将酶液、40％的蔗糖溶液以及0．05％的溴酚蓝按1：0．5：0．5(体积比)混合，在400 V恒压下进行电泳。电泳结束后取出凝胶，在ABTS。醋酸钠的缓冲液中(pH值为4．0)染色，有漆酶的蛋白带则呈绿色。

1.3.2漆酶的定量分析法

1.3.2.1用分光光度计测定漆酶酶活

以ABTS为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。Wolfenden and Wilson分别对5 mmol／L ABTS加入20t比mol／L的抗坏血酸盐的测定溶液，于不同波长进行了光谱扫描，发现纯ABTS呈浅蓝绿色。且在415 nm处有吸收峰；而加了抗坏血酸盐的溶液为无色，在415 nm处无吸收峰。ABTS的最大吸收峰在340nm，ABTS的阳离子自由基的最大吸收峰在415nm。由此推断，在ABTS的溶液中含有极少的ABTS阳离子自由基。它们在更强的还原剂作用下被还原为ABTS。以ABTS为底物进行漆酶的定量分析，通常在420nm下测定3 min内吸光度的变化。

1.3.2.2用微量热法测定漆酶酶活

望天志采用LKB-2107 Batch型微量热系统，在温度为298．15K，pH=7．4的条件下，测定了漆酶催化氧化底物3，4，5-三羟基苯甲酸、邻苯三酚、邻甲氧基酚的活性，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制成pH=7．4的缓冲液。该法操作简单，所用样品量少，不需要光学透明的样品，对酶的悬浮液也能直接测定，对反应体系没有任何限制或干扰。

1.3.2.3用脉冲激光光声法测定漆酶酶活

阎宏涛等首次采用脉冲激光光声法测定了漆酶酶活。试验了入射激光能量、激光照射时间和温度变化等因素对漆酶活性的影响；建立了测定漆酶的光声分析方法，检测限为3ug，是一种高灵敏度的生物样品分析方法。

1.4典型染料废水的色度分析方法

有色工业废水常给人以不愉快感，并降低受纳水体的透光性，影响水生生物的生长。准确的色度表征对有效处理该类废水意义重大。根据是否去除浊度，可将水样色度分为真色与表色。为保证测定值的可比性，国内外相关标准多以真色作为表征指标^[9]。目前常用的色度测定方法分为目视比色和分光光度两类。

1.4.1目视比色法

目视比色法又包括铂钴比色法、稀释倍数法等，其中稀释倍数法多用于工业废水的色度分析^[9]。但是稀释倍数法不可避免地带有个人主观性和随意性，无法实现准确定量。因此要找到合适的补充方法、建立两者的数学关系具有重要意义。针对稀释倍数法的不足之处可用分光光度法进行改进，选用废水的最大吸收波长比色,以仪器的检出限为稀释终点,改进稀释倍数法,统一判别标准,提高其测定方法的准确度^[10]。

1.4.2分光光度法

分光光度法可作为对目视比色法的补充，又可分为特征波长法、ADMI3波长法、面积积分法等，其中ADMI3波长法一般用于染料废水处理。颜色表示真色，是去除浊度的水的颜色。而颜色的种类多种多样,一般一种颜色在可见光范围内只对应一个最大吸收波长，由于颜色发射波长与其最大吸收波长是互补的，因此最大吸收波长定性了水体呈何种颜色。最大吸收波长对应的A_max是颜色对可见光范围内最大吸收波长光的最强吸收，用A_max去定量色深是与人的目视想一致的^[9]。分光光度法比目视比色法定量科学准确,可减少人为误差,且同样方便、快捷、用样量少^[10]。

1.5漆酶用于染料废水脱色的条件研究^[7]

随着染料脱色真菌多样性的发掘和真菌脱色机理的研究不断深入，将真菌细胞固定化并进而应用于各种类型的反应器处理模拟废水甚至实际的染料废水的研究也得到了很好的发展，有些真菌已经被应用于实践当中，并取得了较为理想的效果。

Susla等研究发现，在固定化条件下漆酶的产量得到了明显提高。达到了在流体条件下无法达到的水平，他们还分离得到了相对分子质量同为68000的两种漆酶(Lcl、Lc2)，发现两种漆酶的脱色效率大大不同，Lcl远远高于Lc2，更具有实际应用价值。多项研究表明，真菌在固定化条件下的生长速率和对染料的降解速率都明显提高，这是因为固定后的微生物细胞可以实现高密度填充。因而可进行高密度连续的微生物发酵。极大提高了生产效率，而且菌体经固定化口f以反复使用，发酵完毕，菌体与发酵液易于分离，后处理T艺简单，成本降低．所以，固定化真菌在实际的废水处理中应用更广泛．

Mielgo等应用Pchrysosporium在连续填充床反应器里进行了偶氮染料降解研究；结果表明，在好氧条件下。当染料的容积负荷为0．12 g/L/d、温度为37℃和水力停留时间为24 h时。该反应装置对染料的脱色率达至95％以上。研究认为，将细胞固定化有利于真菌的生长和酶的产生，有利于在反应器中长时间保持菌的密度以及胞外酶的浓度．安世杰等构建了白腐真菌膜生物反应器降解复配染料废水，通过研究发现，在白腐真菌膜生物反应器营养源调控研究中。得到如下结论：将碳源浓度从30g／L降低到10 g／L、氮源浓度从560mg(N)／L(20mmol／L尿素)降低到56mg(N)／L(2 mmol／L尿素)后，同样获得了良好的复配染料脱色效果#8943;1．研究还表明．白腐真菌生物膜反应器处理染料废水的适宜停留时间为72 h．熊小京等采用厌氧／好氧膜生物反应器(A／OMBR)，以艳蓝KN#8212;R活性染料为模拟染料，在不同进水pH条件下，探索TpH变化时厌氧与好氧污泥对染料的降解情况；结果表明．碱性进水有助于提高厌氧脱色效果，酸性进水有利于提高好氧脱色效果。

1.5.1温度对染料脱色的影响^[4]

温度对反应染料脱色主要是通过时漆酶的反应活性和热稳定性的影响进一步影响脱色效果的，要缩短染料的脱色时间，需要提高温度来提高漆酶活性，并结合考虑漆酶与染料作用时问和漆酶的热稳定性的关系，最终确定一合理的反应温度，从而提高脱色速率。

1.5.2 pH对染料脱色的影响

彩绒革盖菌漆酶适宜在酸性条件下与底物作用。体系pH影响了漆酶活性和底物的稳定性，进而影响到染料的脱色效果。^[4]

1.5.3酶活力对染料脱色的影响

随着酶活力的提高，陔反应速度迅速提高，随后速度提升并缓慢趋于稳定。酶活力越高，脱色率也就越高^[4]。

1.5.4使用介体对染料脱色具有促进作用

据有关文献的总结，ABTS的加入有效扩大了漆酶的脱色范围，使原本难被漆酶降解的染料也呈现出一定的脱色效果，并且还能提升脱色率。

1.5.5染料初始浓度对脱色率的影响

漆酶的催化反应速度和最终脱色率随着染料浓度的增加而增大^[8]，而当浓度大到一定值时，脱色率又会降低，反应速度也下降。这是因为，在染料浓度较低时，漆酶的活性中心并没有与底物染料完全结合，增加底物浓度，中间产物的形成与产物的生成均增加，当增高至一定浓度时，酶的活性中心全部被底物占据，此时再增加底物也不会增加中间产物，也就不会降解染料。所以在漆酶酶活一定时，染料底物浓度过高，会导致最终脱色率降低。

结论：漆酶在染料废水处理的应用非常广泛，但其脱色率还受到工艺条件的影响，所以要通过实验来优化其工艺条件。漆酶活性易受到温度、pH、金属离子等的影响，因此有必要从这几个方面着手研究，探索能提高漆酶酶活的工艺条件，提升其脱色率，发挥漆酶的潜在应用价值。

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