1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1．脂肪酶概述及其应用

1.1脂肪酶概述

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3，三脂酰甘油酰基水解酶）是分解脂肪的酶，在动植物体和微生物中普遍存在。它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反应：甘油三酯 水→甘油 游离脂肪酸[1]。由于脂肪酶是水溶性的，它的天然底物是脂溶性的，因此脂肪酶催化的水解反应发生在油水界面上。脂肪酶的活性中心是疏水性的，通常被一层成为”lid”结构的亲水氨基酸所覆盖，当在水相和有机相的界面时，氨基酸盖会打开暴露出酶的活性中心，与有机相中的底物结合[2]。

近年来，随着非水酶学研究的不断深入，脂肪酶的应用已经超出了油#8212;水界面上进行水解反应的范围，被广泛应用于手性化合物的拆分[3]、化工合成中间体的选择性基团保护、酯合成、高聚物合成、肽合成等反面，应用前景十分广阔[1]。

1.2脂肪酶的来源

脂肪酶在微生物界分布很广,目前已发现假单孢菌、曲霉、青霉、微球菌等多种微生物可产脂肪酶,根据氨基酸序列的同源性可将微生物脂肪酶分为6 个大类。据不完全统计,细菌有28 个属、放线菌4 个属、酵母菌10 个属、其它真菌23个属均能产脂肪酶。在各种来源的脂肪酶中,以细菌脂肪酶在有机相中催化的反应类型多、反应活性及稳定性最高。

1.3耐有机溶剂脂肪酶的作用特性

1.3.1稳定性

在有机相系统内脂肪酶的稳定性提高,如果脂肪酶结合的水被除去或被易于与水混溶的有机溶剂稀释,则酶一般会失去活性,但在不发生失活的条件下,只要有微量的水并且水的活度降低,那么就会大大降低脂肪酶热失活的速度。

1.3.2催化活性

酶的催化活性与溶剂疏水性参数间有着较大相关性,在疏水性较强溶剂中酶的催化活力较高,相反在亲水性较强溶剂中酶的催化活力较低。

1.3.3选择性

脂肪酶的选择性包括底物专一性、对映体选择性、前手性选择性和位置选择性等。脂肪酶的对映体选择性受溶剂的影响非常显著。在有机介质中,通过改变溶剂的极性可以改变脂肪酶的对映体选择性。因为溶剂极性能在一定程度上使酶的活性中心构象发生改变,直接影响外消旋化合物的两个对映体与酶活性中心的结合,从而影响酶的对映体选择性。另外,溶剂还会影响产物的构型,甚至可使酶的对映体选择性发生翻转。

1.4 脂肪酶在有机溶剂体系中催化反应的优势

（1）大部分有机化合物在非水介质中有更高的溶解度，有利于高浓度底物连续进行生物转化；

（2）可进行水不溶性物质的催化转化，大大拓展了酶的作用底物范围；

（3）与水溶液相比，从有机溶剂中回收产品和酶更为容易；

（4）减少或防止由于水的参与所引起的副反应，如水解反应；

（5）酶的热稳定性大大提高；

（6）反应器不易被微生物污染。

1.5 脂肪酶催化酯交换反应的拆分机理概述

许多人对酶实现对醇的两个对映体的拆分机理进行了研究。Kazauskas[10]等用一个经验公式解释脂肪酶对2-醇的拆分机理，他们认为当底物具有两个相差很大的取代基团时，是手性中心取代基的大小和疏水性决定了消旋过程哪种对映体优先反应,如图1所示[11,12]。从对映体选择性角度上看，几乎所有脂肪酶都遵循Kazlauskas规则，但蛋白酶通常显示相反的对映体选择性[13]。而Cygler[15]等认为醇的快反应（R）异构体能够更好地与酶契合，这是因为酶活性中心的丝氨酸更倾向于和快反应异构体中的羟基形成氢键。Noriho Kamiya[16]等对脂肪酶拆分小璇醇的动力学研究，发现两个异构体均可以相同的方式和酶的活性部位结合，不同的是活性中心的氨基酸残基和醇羟基之间的作用力，使得只有一种结合物能够进行下一步反应。

图1.基于二元醇拆分建立的Kazlauskas规则[10]

Fig.1 Kazlauskas#8217;rule for resolution of secondary alcohols[10]

1.6 假单胞菌脂肪酶催化应用研究进展

脂肪酶是有机合成中一种重要的生物催化剂，然而应用较广的商业化脂肪酶主要来自真菌，如Candida cylindracea柱状假丝酵母，Candida antarctica南极假丝酵母，Aspergillus niger黑曲霉，Rhizopus arrhizus根霉和Rhizomucor miehei毛霉。假单胞菌脂肪酶因其对手性醇较高的立体选择性和天然耐受有机溶剂等性能被广泛用于有机合成[17]。根据不同菌种来源，商业化的假单胞菌脂肪酶有Pseudomonas fluorescence lipase（PFL），Pseudomonas/ Burkholderia cepacia lipase（PCL/BCL），Pseudomonas sp. Lipase（PSL），Pseudomonas aeruginosa lipase（PAL）和Pseudomonas stutzeri lipase（PTL）等。Pseudomonas cepacia 比其他微生物产的脂肪酶活性更高，且PCL在酯水界面上水解活性较高，能较好催化天然底物橄榄油的水解[18]。此外，假单胞菌脂肪酶可用于手性拆分一系列医药中间体。

用假单胞菌脂肪酶手性拆分制备多种医药中间体，其酶源、催化体系、转化率和选择性汇总见表1。

表1. 假单胞菌脂肪酶拆分手性醇

Tab 1. Resolution of chiral alcohols by Pseudomonas lipase

底物	酶	酰基供体	溶剂	载体	选择性	转化率	参考文献
1-苯乙醇	PCL，PSL	乙酸乙烯酯	超临界CO2	陶瓷颗粒	eep=99%	85%	[4-8]
2-辛醇	PFL，PCL，PSL	乙酸乙烯酯	正庚烷	改性分子筛SBA-15	eeS=99%	84%	[9-12]
苯甲酰苯甲醇	PTL	丁酸乙烯酯	THF	树脂小球	eepgt;99%	90%	[13, 14]
4-羟基-3-甲基-2-(2-丙烯基)-2-环戊烯-1-酮	PCL	乙酸乙烯酯	无溶剂	硬脂酸	Egt;100 eep=91.4%	52.9%	[15]
薄荷醇	PCL	异丁烯酸肟	二异丙醚	-	eep=98%	96%	[16]
2-O-苄基甘油	G6 lipase *	乙酸乙烯酯	环己烷	-	eep=97%	36%	[17]
α-亚甲基-β-羟基酯	PSL	乙酸乙烯酯	正庚烷	聚环氧乙烷	ees=99% eep=99%	50%	18]
γ羟基酰胺	PCL	乙酸乙烯酯	甲苯	PS-C	ees=98%	90%	[19]
芳基氯醇	PCL	乙酸异丙烯酯	甲苯	PS-C	eepgt;99%	gt;99%	[20]
N乙酰基半缩醛胺	PCL，PFL	乙酸异丙烯酯	正己烷	-	eepgt;99%	-	[21]
1-[二(4-甲氧苯基)]甲丙醚-2-醇	PCL	乙酸乙烯酯	异丙醚	陶瓷颗粒	-	50%	[22]
1-(4-异丙基环己基)乙醇	PCL	乙酸乙烯酯	THF	PSL-C I	eep=98% eesgt;99%	50%	[23]

*非商品化假单胞菌脂肪酶

2．手性及手性拆分简介

2.1手性及手性化合物

手性（Chirality）是三维物体的基本属性，是指化学分子的实物与其镜像互为对应而又不能重叠的现象[4]。1848年Pasteur利用放大镜和镊子成功地分离了酒石酸钠铵盐的外消旋体标志着手性分离的开始[5]。大量事实证明手性是自然界的基本属性之一，如自然界中存在的糖大多为D-型，天然存在的氨基酸绝大多数为L-型，蛋白质与DNA都是右旋体等[6]。

2.2研究手性的意义

在生物体的手性环境中，分子之间严格的手性匹配是分子识别的基础。如酶高度的底物、区域、位点、立体催化选择性，抗原与抗体的特异性识别，受体与供体的专一性作用等；再如药物、农药及其他生物活性物质的手性对于其在体内的吸收、转运、组织分配、与活性位点的作用、代谢、消除等体内过程有着重要影响，这些将直接关系到药物的药理作用、毒理作用、临床效果、药效的发挥等[1]。沙利多胺（Thalidomide，即镇静药酞胺呱啶酮）导致的悲剧迫使人们认识到药物手性问题的极端重要性[7]。

2.3获得手性化合物的方法[8]

获得手性化合物的途径主要有：

（1）从天然存在的光学活性化合物即”手性池”中获得

许多天然立体控制的全合成往往选择一个手性物为起始原料。目前常用的手性起物有氨基酸类、糖类、生物碱等。直接从天然来源获得的手性化合物原料丰富、价廉易得、生产过程简单、产物光学纯度高等优点，但受到原料来源限制难以广泛实施。

（2）不对称合成法

不对称合成法是在催化剂或酶的作用下合成得到单一对映体化合物的方法。化学不对称合成需要手性源，而生物不对称合成不需要手性源并具有高度立体选择性，反应条件温和，但对底物要求高。

（3）外消旋体的拆分

外消旋体的拆分是在手性助剂的作用下，将外消旋体拆分为纯的对映体，这种方法已经被广泛使用。主要包括直接结晶拆分发（物理法）、化学拆分法、酶或微生物法、色谱拆分法（手性色谱柱分离）、膜拆分法[9]。其中，由于酶法拆分具有选择性好、价格适中、整体选择性（包括化学选择性、区域选择性、对应异构体选择性）高、反应条件温和、污染小、在有机溶剂中反应较稳定（尤其是耐有机溶剂脂肪酶）等特点，因而被广泛应用。酶法进行手性拆分的方法包括动力学拆分、动态动力学拆分、去消旋化或对映体收敛转化等。[14]

3．左羟丙哌嗪的拆分制备

3.1羟丙哌嗪简介

羟丙哌嗪，系统命名为3-(4-苯基-1-哌嗪基)-1,2-丙二醇，化学式（分子式）：C13H20N2O2，结构式如图2所示。易溶于甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷，难溶于丙酮。临床上其左旋体左羟丙哌（Levodropropizine, Levotuss）为一种新型的手性镇咳祛痰药[19]，它通过对气管、支气管中的C- 纤维的选择性抑制并对支气管平滑肌的松弛而产生镇咳效果[20]，用于急性上呼吸道感染和急性支气管炎引起的干咳和持续性咳嗽。与现在的镇咳药物相比, 左羟丙哌嗪具有选择性高、疗效好、副作用小等特点，因此国家医药局将其列为推荐开发的品种[21]。

图2.左羟丙哌嗪结构式

Fig2.The Structure of Levodropropizine

3.2羟丙哌嗪手性拆分方法

（1）手性HPLC法

国内外已有报导用HPLC法拆分羟丙哌嗪。黄勇等[23]使用Chiral-OC手性柱，以异丙醇-正己烷（15:85,V/V）为流动相、流速0.5mL/min、检测波长250nm将羟丙哌嗪酯化衍生后进行拆分，分离度达4.0，左、右旋光异构体衍生物峰面积比值精密度（RSD）为0.63。高效液相色谱可用于羟丙哌嗪的手性拆分，方法简便，精密度高，但操作量小不利于工业化大规模生产。

（2）酶催化的动力学拆分法

Daniele等[22]运用脂肪酶Amano PS对羟丙哌嗪进行动力学拆分，并探究了在不同溶剂中该酶的催化拆分性能。其反应化学方程简式如下：

假单胞菌脂肪酶已广泛应用于手性醇以及含羟基化合物的手性拆分，反应体系一般为纯有机溶剂，通常用乙酸乙烯酯作为酰基供体，使得转酯反应朝产物生成方向不可逆进行，另外还报道了新型的溶剂用于手性拆分：如离子液体和超临界CO2。固定化酶在手性拆分中应用广泛，不仅可以重复使用，而且适当的固定化载体能提高游离酶的活力和在溶剂体系中的稳定性，并有研究者将微波技术引入拆分过程中。动力学拆分理论最大转化率为50%，而结合化学消旋应用动态动力学拆分能大大提高转化率，同时取得较好的对映体选择性。

4．本课题的研究意义

单一构型手性药物及其中间体的合成与药理学研究是现代有机合成工业和医药工业中的一个热点研究领域。手性药物已成为国际新药研究与开发的新方向之一。脂肪酶是目前最好的大范围制备具有光学活性醇的生物催化剂之一。脂肪酶除了在有机溶剂中具有高度催化活性和热稳定性之外，还同时具有高对映异构选择性和配基的广阔底物专一性。目前将脂肪酶用于手性拆分仍然是一个热点，且脂肪酶来源较为广泛，因此适合用于研究[1]。

耐有机溶剂脂肪酶产生菌是一类相对新型的极端微生物，筛选该类菌种获得耐有机溶剂脂肪酶已成为近年来研究的热点。然而由于将此类酶应用于非水相催化的报道较少，并未发挥此类酶在非水相中催化天然的优势，且生物催化剂实现工业化必须可以重复利用，而商品酶的使用增加了成本，因此采用廉价载体固定化自制耐有机溶剂脂肪酶、开发其在非水相中催化能力具有广泛的应用前景。

5．参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1本课题所研究的问题

（1）本课题采用耐有机溶剂假单胞菌ycj01所产脂肪酶ycj01对羟丙哌嗪进行手性拆分，探讨对脂肪酶不对称立体选择性进行改善的方案；

（2）研究不同反应条件对手性拆分效率及产量的影响，并对拆分体系进行优化，探索出最佳反应条件。