1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1. 保护氨基酸的意义及应用前景

目前随着人们的生活水平的日益提高，对生活的质量要求更高。需要更新、更好、更有效、更安全的生物类药物战胜病魔，而多肽类药物正是满足这种需求。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们己发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象^[1]。

随着多肽类药物的发展正越来越引起医学界的关注。目前全世界获批的多肽类药已经超过50个，同时有约140个多肽类药物在临床研究中，涉及激素、神经、细胞生长和生殖的各个方面，具有营养性、调节性、抗病毒等多种功能。2010年，多肽类药物的全球市场规模约为130亿美元，年复合增长率为7.5%至10%，超越了全球医药市场的平均增长速度，并且出现了全球销售超过10亿美元的重磅炸弹级药品^[2]。此外多肽类药物和传统的药物相比虽然有更大的疗效、选择性和特异性^[3-4]，但是稳定性不理想，需要做一些必要的修饰来改善稳定性，提高疗效^[5]。

目前，多肽类药物的主要生产方法有化学合成、组织提取和基因表达等方法。但是组织提取和基因表达限于规模和技术的限制，因此在可以预见的未来，经典的固相多肽合成方法仍将是大部分多肽药物生产的首选方式^[6]。经典的固相多肽合成中氨基酸的保护是必不可少的。

2. 氨基酸氨基保护基简介

目前氨基酸保护基主要分为3类:α-氨基保护基、α-羧基保护基以及侧链活性基团保护基。由于本文仅涉及到α-氨基的保护，因此仅介绍α-氨基保护基。

氨基原则上可采用酰化、烷基化、烷基酰化等反应进行可逆屏蔽。过去10年,发展了上百种不同的氨基保护基团,主要包括烷氧羰基型保护基团、酰基型保护基团和烷基型保护基团。已报道的研究结果表明,不存在一种通用的理想氨基保护基团用于多肽固相合成^[7]。

2.1 烷氧羰基型(氨基甲酸酯型)保护基团

这类保护基团主要包括苄氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴氧羰基( Fmoc)、2-(4-硝基苯磺酰基)乙氧羰基(Nsc)、1,1-二氧苯基(邻)2-噻吩甲氧羰基(Bsmoc)、2-(甲磺酰基)-3-苯基-2-丙烯氧羰基(Mspoc)、2-(叔丁磺酰基)-2-丙烯氧羰基(Bspoc)、环戊烷氧羰基(Poc)。

Z、Boc、Fmoc是最常见的3种氨基保护基团。Z是一种使用时间很长的氨基保护基,至今仍有广泛应用。其优点是制备容易，得到的Z-氨基酸易结晶并且稳定，活化时不易消旋，可以在H2/ Pd、HBr/ AcOH、Na/液氨等条件下脱去该保护基团^[8]。Boc可用于大部分多肽合成的偶联过程,可以在酸解条件下除去,同时可避免受到催化氢化、碱水解和钠/液氨还原的影响。Boc通常在无水TFA、0℃反应条件脱除^[8]。Fmoc是氨基甲酸酯型氨基酸保护基团中,唯一广泛应用的可以在弱碱条件下解离的基团,Fmoc脱保护可使用稀哌啶溶液或二乙胺DMF溶液,在室温下完成^[9]。

2.2 酰基型保护基团

这类保护基团主要有羧酰基型和苯磺酰基型两类，包括三氟乙酰基(Tfa)、对甲苯磺酰基(Tos)、邻位硝基苯磺酰基(oNbs)。

Tfa最早由Weygand在1952年引入多肽合成^[8],其脱除条件相对温和,用哌啶或氢氧化钠处理可容易地脱去。但活化时容易消旋,并且在碱水解时容易断链,所以被广泛应用。

Tos也是早期使用的保护基团,稳定性非常好^[9],只能用Na/液氨处理脱去,不受酸碱作用或催化氢解作用影响。但由于Na/液氨处理操作麻烦,并且会导致某些肽键的断裂,因此目前较少使用。

在Tos的苯环上引入邻位硝基,得到oNbs后,情况就得到很大的改善。磺胺保护基团允许氨基酸的N-酰化,而没有吡酮作用机理产生的消旋化。并且此保护基团用苯硫酚或烷烃硫醇处理就可除去,克服了Tfa和Tos不易脱除的缺点。

2.3 烷基型保护基团

烷基型保护基团主要有三苯甲基(Trt) 、N-1-(4,4 -二甲基-2,6-二氧环亚己基)乙基(Dde)、N-1-(4-硝基-1,3-二氧茚满-2-烯)乙基(Nde)。

Trt是很常用的烷基型保护基团,脱除的条件温和^[8],可以用无水HCI/MeOH、TFA或HBr/AcOH脱去。由于Trt有很大的立体空间位阻,一般很难导入与氨基结合,并且侧链上的Trt比主链上的Trt稳定,因此Trt的应用多用于侧链氨基酸的保护,而对α-氨基的保护应用较少。Dde和Nde是新型的烷基型氨基保护基团。

Dde对TFA和哌啶很稳定,要用2%(v/v)的肼/DMF脱去,因此选择合适的脱保护条件,就可以保留主链上的氨基保护,而脱去侧链上的氨基保护基团,进而合成支链肽。

3. 保护基的选择

由于现今多肽合成中最为常见的策略为Fmoc保护策略和Boc保护策略^[10]。且在酸性条件下，Fmoc保护基特别稳定，而对碱性条件则非常敏感，故通常可与酸敏感保护基Boc或Z一起使用保护含有活泼侧链基团的氨基酸^[11]，应用广泛。此外Fmoc具有很强的紫外吸收，最大吸收波长为267nm、290nm、301nm ，因此可用紫外吸收来检测^[12]。再者Fmoc可与大范围的溶剂、试剂相兼容，机械稳定性高，可用多种载体和多种活化方式等。因此当今多肽合成中最常用的就是Fmoc保护基团。

因此本文选用Fmoc作为保护基合成保护氨基酸。Fmoc型保护基一般有Fmoc-Cl ^[12]和Fmoc-Osu^[13]两种，本文选用Fmoc-Cl来进行丙氨酸和甲硫氨酸的氨基保护。

4. Fmoc-丙氨酸及Fmoc-蛋氨酸简介

表 Fmoc-丙氨酸及Fmoc-甲硫氨酸性质

5. Fmoc保护基的脱除

9-芴甲氧羰基（Fmoc）与烷氧羰基不同，芴甲氧羰基（Fmoc）为碱敏感保护基，能在浓氨水或二氧六环一甲醇-4N NaOH ( 30: 9: 1)以及哌啶、乙醇胺、环己胺、毗咯烷酮等氨类的溶液中脱去^[14]。

6.Fmoc-丙氨酸和Fmoc-蛋氨酸的制备流程^[15]

a.Fmoc保护的两种氨基酸分别以蛋氨酸和丙氨酸为原料，在碱性条件，控制温度，滴加Fmoc-Cl，最后调酸，抽滤，得到对应的目标产物。

b.选择不同的常用溶剂及有机碱和无机碱，考察反应使用的溶剂及所选用的碱，达到提高收率及降低成本的目的。

c.因Fmoc自身有紫外吸收，可建立高效液相色谱法检测两种保护氨基酸的含量。

图 Fmoc-丙氨酸和Fmoc-蛋氨酸的制备

参考文献

[1] 石常青,张雅文,沈宗旋.两种N-保护氨基酸的合成[J].苏州大学学报, 2004(20):60-61.

[2] 杜秀敏.Fmoc系列保护氨基酸的制备研究[C].中国科学院上海冶金研究所,2004.

[3] 高德民,刘金峰,王凤山.多肽药物结构稳定性的的研究进展[J].中国医药生物技术,2007(2):380-382.

[4] 陈正英.9-芴甲氧羰基作为N~α-氨基保护基在多肽合成中的应用[J].氨基酸杂志,1987(4):22-30

[5] Louis A. Carpino. Preparation and use of t-butyl cyanoformate and t-butyl 8iminodicarboxylate[J]. Carpino, 1964:2820-2821.

[6] 陈心,罗素兰,张本.多肽固相合成的研究进展[J].生物技术,2006(16):81-83.

[7] 邱芊,陈永森,朱颐申等.固相多肽合成中氨基酸保护的研究进展[J].化工时刊,2005(19):56-62.

[8] Sewald N,Jakubke H D，Chemistry and Biology.Wiley-VCHVerlag Publ,2002 ,135～207

[9] Novabiochem Handbook : synthesis notes

[10]Janice Reichert, Ph.D.. Trends in the clinical development and approval of peptides[J].Peptide therapeutics foundation, 2010:7-10.

[11]赵萍萍,徐大刚,廖晓全等.保护氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH的合成方法优化[J].化学世界,2008(9):549-552.

[12]邢云英.丙氨酸的氨基保护[J].天津纺织科技,2005:29-30.

[13]郑彦慧,张艳平,张浩等.Fmoc保护氨基酸与Wang树脂的缩合反应[J].高等学校化学学报,2008(29):1769-1772.

[14]Parfentev L N, Shamahurin A A, Esters of procarbonic acid[J]. Shornik Rabot Khim, 1939,15:67-74.

[15]邢云英.丙氨酸的氨基保护[J].天津纺织科技,2005:29-30.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案