摘 要

生物活性多肽及肽类药物具有生物活性高，特异性强，受体亲和力好，毒性低，对人体损伤小等优点。另一方面，生物活性多肽及肽类药物的缺点是稳定性差，体内易降解，受到酸、碱、高温、有机溶剂等影响较大，服用不便。

本实验采用固相合成法进行生物活性多肽的制备，采用LC-MS、HPLC方法对自制多肽进行质量评价以及主成分分析。在实验过程中，对制备液相色谱的溶样浓度、溶样方法以及制备色谱梯度进行了优化，纯化所得的多肽样品纯度为96.04%；在HPLC分析中，对色谱柱、流动相等条件进行了优化，以检测方法的稳定性、精密度、线性和范围等方面为指标初步建立了一套多肽样品的HPLC检测方法，并将该色谱条件运用到了多肽样品的分析测定中。最终优化的条件为：伊利特Supersil ODS2 5m 4.6mm*150mm色谱柱；以含0.1%TFA的水、乙腈分别作为流动相A和B，流速为1.0 mL/min，检测波长UV 214 nm，进样量20 L；柱温 25 C。检测结果表明，分析方法的检测限为0.5 g/mL、定量限为5 g/mL；溶液浓度范围在5g/mL至1.00mg/mL 时峰面积与多肽样品浓度之间存在线性关系，其中相关系数R为0.9992；精密度相对标准偏差（RSD）为0.029％（n=6）。

关键词：自组装多肽，固相合成法，HPLC，分离分析，质量评价

ABSTRACT

Peptide drugs have high biological activity, high specificity, good affinity with receptors, low toxicity, and little damage to human body, and have unique advantages. On the other hand, compared with small molecule drugs, peptide drugs have the biggest disadvantages of poor stability, easy degradation in the body, easy to inactivate under conditions of acid, alkali, high temperature, organic solvent, etc. There are many inconveniences. The detection method of polypeptide drugs is also limited by its own shortcomings.

In this experiment, solid phase synthesis was used to prepare the peptide sequence, and LC-MS and HPLC methods were used to evaluate the quality of the peptides to be tested in this laboratory and the principal component analysis. During the experiment, the concentration of the solution, the sample preparation method and the preparative chromatographic gradient were optimized. The purity of the purified peptide sample was 96.04%; the pH, column temperature and flow used in the RP-HPLC analysis. The conditions of phase and buffer salt were optimized. A set of HPLC detection methods for peptide purified samples were established for the stability, precision, linearity and range of the detection method. In the analysis of the assay. The final optimization conditions were: Elite Supersil ODS2 5m 4.6mm*150mm column; water-acetonitrile containing 0.1% TFA as mobile phase A and B, flow rate 1.0 mL/min, detection wavelength UV 214 nm, The sample volume is 20L; the column temperature is 25℃. The test results indicate that the detection limit was 0.5g/mL and the limit of quantification was 5g/mL. Between the peak area and the peptide refining sample concentration ranged from 5g/mL to 1.00 mg/mL. Linear relationship, where the correlation coefficient R is 0.9984; the precision relative standard deviation (RSD) is 0.029% (n=6)..

Keywords: Self-assembling peptide, solid phase synthesis ,HPLC, purification and analysis, quality evaluation

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 5

1.1 多肽的简介 5

1.2 多肽的固相合成 5

1.2.1多肽合成的原理 5

1.2.2多肽合成方法 6

1.3 多肽的分析及纯化方法 7

1.3.1 高效液相色谱（HPLC） 7

1.3.2 亲和层析 8

1.3.3毛细管电泳 8

1.3.4质谱分析 8

1.3.5核磁共振分析 9

第二章 多肽的合成 10

2.1实验试剂和仪器 10

2.1.1 试剂 10

2.1.2 仪器 11

2.2实验方法 11

2.2.1 芴甲氧羰基标准曲线的建立 11

2.2.2 2-Cl树脂合成线性八肽 11

2.2.3 氨基酸序列SFSFKFKF的质谱分析 12

2.3结果与讨论 12

2.3.1芴甲氧羰基标准曲线 12

2.3.2氨基酸序列SFSFKFKF的LC-MS分析图 13

第三章 自制多肽粗品的纯化制备 15

3.1实验试剂和仪器 15

3.1.1 试剂 15

3.1.2 仪器 15

3.2实验方法 15

3.2.1样品溶液的制备 15

3.2.2流动相配置 16

3.2.3确定制备色谱条件 16

3.3结果与讨论 16

3.3.1制备色谱条件的优化 16

第四章 纯化多肽的初步质量分析方法 20

4.1样品溶液的制备 20

4.2流动相的配制 20

4.3色谱条件的筛选 20

4.3.1紫外吸收波长 20

4.3.2流动相 20

4.3.3色谱柱 20

4.4分析方法的验证 21

4.4.1 方法稳定性考察 21

4.4.2 线性关系考察 21

4.4.3 精密度实验 21

4.4.4 检测限和定量限考察 21

4.5结果与讨论 22

4.5.1最佳条件的选择 22

4.5.2分析方法的验证 23

第五章 结论与展望 25

5.1 结论 25

5.1.1样品多肽纯化结论 25

5.1.2 纯化后多肽的分析结论 25

5.2展望 26

参考文献 27

致谢 28

第一章 文献综述

1.1 多肽的简介

多肽(peptide)是一种由α-氨基酸组成，以肽键连接的化合物^[1]。自组装多肽是指一类能够依赖分子间的相互作用，在一定条件下自发形成共聚物的多肽分子^[2]。多肽自组装主要有自发型和触发型自组装：自发型自组装是指将多肽溶解在水溶液中，可以自发地形成组装体，触发型则是通过改变外界环境，如pH 值、温度、离子浓度等，引导多肽自组装为组装体^[3]。无论是自发性自组装还是触发型自组装，两者都是基于多肽的二级结构(α螺旋、β折叠和β发夹)或者其结构的两亲性，由于触发型自组装过程具有可逆性，为多肽自组装的潜在应用提供了良好的可控性，因此目前自组装主要集中在触发型自组装^[4]。

β折叠是一种蛋‌白‌质二级结构，肽键平面以Z字形折叠，相邻肽链主链的N-H和C=O之间形成有规则的氢键，所有的肽‌键都参与链间氢键的形成，氢键垂直于β-折叠的长轴，肽链的氮端在同侧为顺式，两残基间距为0.65nm，不在同侧为反式，两残基间距为0.70nm ^[5]，能形成β折叠的胺基酸残基通常很小并且不携带相同的电荷，这样有利于多肽链的伸展，如甘氨酸、丙氨酸在β折叠中出现的几率较高，基于β折叠的多肽自组装研究很多, 其中以亲疏水氨基酸残基相互穿插构成的多肽居多, 一个典型代表为Lego 肽^[6]。经研究表明, 不仅单个多肽片段能够独立地组装β-折叠结构，而且可以在分子间非共价相互作用上组装两个或更多个多肽以形成具有β-折叠结构的单元。

1.2 多肽的固相合成

1.2.1多肽合成的原理

多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破，其最大特点是不需要纯化中间产物，合成过程可以连续进行，基本过程如下：合成通常从C端向N端(氨基端) 进行合成，多肽固相合成的基本原理是将目的肽的第一个氨基酸C 端通过反应生成共价键与固相载体相连，再以已经连接上的氨基酸N 端为合成起点，脱去已连接氨基酸的氨基保护基，与过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，使肽链延长，重复以上操作，以致达到所需的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过分离纯化，获‌得‌目标多肽^[7]。

1.2.2多肽合成方法

1.2.2.1多肽的固相合成