摘 要

大部分氧化还原酶的催化反应需要辅酶NAD 和NADH作为氧化剂或还原剂参与，由于氧化还原酶应用广泛而辅酶价格昂贵,极大的限制了氧化还原酶的应用，使得辅酶的合成逐渐成为研究热点。烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(NMNAT, EC 2.7.7.1)在NAD 的生物合成过程中起着决定性的作用，且催化反应不可逆，产物易分离，底物相对廉价。因此，研究高效的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶进而合成NAD 具有重要意义，对于推动氧化还原酶在工业上的应用也有着极为重要的研究价值。

本研究中所使用的烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶基因由金斯瑞生物科技有限公司合成。本文较为全面的的综述了NMNAT基因的表达、pET-28a-NMNAT目的基因的构建以及诱导表达。在Escherichia coli BL21(DE 3) 中表达，对其表达量，表达方式的优化，以及烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶酶活的定性测定。

关键词：烟酰胺核苷腺苷酰转移酶 克隆表达 NAD合成 酶学性质

Cloning, Expression and Characterization of Nicotinamide Nucleoside Adenylyltransferase gene

ABSTRACT

Most oxidoreductase catalytic reaction requires the coenzyme NAD or NADH as an oxidizing or reducing agent to participate. Since the widely used oxide reductases coenzyme expensive, greatly limiting the application of oxide reductases. Making the coenzyme gradually become a hot topic. Nicotinamide nucleoside adenylyltransferase (NMNAT, EC 2.7.7.1) plays a decisive role in the NAD biosynthetic processes. And the catalytic reaction is not reversible, the product easy to separate, relatively inexpensive substrates. Therefore, the study of efficient nicotinamide nucleoside adenylyltransferase synthesize NAD is important. Promoting oxidoreductase application in industry also has a very important research value.

Nicotinamide nucleosides adenylyl transferase gene used in this study synthesized by GenScript Biotechnology Limited. This article comprehensive review of Construct pET-28a-NMNAT target gene of and gene expression NMNAT and inducible expression. Expressed in Escherichia coli BL21(DE 3). Optimize the expression, and nicotinamide nucleotide adenylyltransferase qualitative determination of enzyme activity.

Key Words: NMNAT; Cloning and Expression; NAD synthesis; Characteriza

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 - 1 -

1.1烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的分类、来源和结构 - 1 -

1.2 NAD 的生物合成途径 - 2 -

1.3本课题的立题背景、意义及研究内容 - 3 -

第二章 材料与方法 - 4 -

2.1 实验材料 - 4 -

2.1.1 实验试剂 - 5 -

2.1.2 菌株、质粒、工具酶、分子量标准和试剂盒 - 6 -

2.1.3 培养基 - 6 -

2.2 试验方法 - 7 -

2.2.1 NMNAT基因在大肠杆菌中的诱导表达 - 7 -

2.2.2 NMNAT基因在大肠杆菌中的克隆表达 - 8 -

2.2.3重组NMNAT的生化性质研究 - 11 -

第三章 结果与讨论 - 13 -

3.1 NMNAT基因在大肠杆菌中的诱导表达 - 13 -

3.1.1 pET-2a-NMNAT质粒的获取 - 13 -

3.1.2 NMNAT的诱导表达 - 13 -

3.2 NMNAT基因在大肠杆菌中的克隆表达 - 14 -

3.2.1 烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因的获取 - 14 -

3.2.2 双酶切目的基因片段 - 15 -

3.2.3 pET-28a-NMNAT表达载体的构建及鉴定 - 15 -

3.2.4 氨基酸序列分析 - 16 -

3.2.5 重组蛋白的诱导表达 - 17 -

3.2.6 NMNAT 活性的定性鉴定 - 18 -

第四章 结论与展望 - 20 -

4.1 结论 - 20 -

4.2 展望 - 20 -

参考文献 - 22 -

致谢 - 25 -

1. 文献综述

近年来，工业生物催化已经成为生物技术中一个新兴的、具有巨大发展前景的领域，酶作为生物催化剂在工业生物崔华中起着至关重要的作用。在酶的六大类型当中，氧化还原酶占据30%~35%，其在催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等方面发挥越来越重要的作用^[1-3]，对这种类型酶的研究也愈发受到人们的重视。且相比于化学催化剂，其催化的氧化还原反应具有反应条件温和、立体选择性强、副反应少、产物浓度高等特点^[4-5]。然而，氧化还原酶在进行生物催化反应的同时，需要消耗一定量的辅酶，大约90%的氧化还原酶的辅酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD /NADH)作为底物，导致这类辅酶的在工业、科研上的需求也随之剧增。然而，辅酶的价格昂贵，甚至比酶促反应所得产物的价格还要高，而重复利用性和稳定性却很低。

烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(NMNAT, EC 2.7.7.1)在NAD 的生物合成过程中起着决定性的作用^[6]，在NAD 合成的补救途径中，烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶能直接催化烟酰胺单核苷酸生成NAD ，伴随着一分子的ATP还原成ADP。此外，NAD 的代谢在健康和疾病状态中起到重要作用，已经引起了人们越来越多的关注，因而参与NAD 生物合成和代谢的酶也成为各种疾病的药物发现中极具吸引力的靶标。NMNAT在从头合成途径与补救途径中，分别催化由ATP的腺苷酸部分转移到磷酰基NMN或烟酸单核苷酸以形成NAD和烟酸腺嘌呤二核苷酸^[5]。