1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

一、立论依据

1,2-丙二醇是一种重要化工原料，有R、S两种构型。1,2-丙二醇可用作不饱和聚酯树脂的原料；在化妆品、牙膏和香皂中可与甘油或山梨醇配合用作润湿剂；在染发剂中用作调湿、匀发剂，也用作防冻剂，还用于玻璃纸、增塑剂；在制药工业也是重要的手性药物前体。1,2-丙二醇的化学手性合成较难，手性拆分成本较高。目前已经报道了经由二羟丙酮磷酸DHAP、甲基甘油醛合成R-型1,2-丙二醇的途径。但是还未发现从甲基甘油醛能够合成S-型1,2-丙二醇的还原酶。

乳酸是一种常见的发酵产物，多数微生物在厌氧条件下发酵葡萄糖都会产生乳酸。目前工业发酵乳酸的工艺已经成熟,浓度达到200克/升以上。已有文献报道，乳醛还原酶可以将D-乳醛还原成R-1,2-丙二醇，但是还没有发现可以催化L-乳酸还原为L-乳醛的酶。已经发现乳醛脱氢酶可以催化L-乳醛生成L-乳酸，可否经过蛋白质工程将乳醛脱氢酶催化的反应逆转，这样就可以将L-乳酸经过两步还原合成S-1,2-丙二醇，可以构建从葡萄糖发酵生产S-1,2-丙二醇的工艺，也可以实现酶催化转化的工艺。

二、文献综述

醛类脱氢酶是一种广泛存在于原核及真核生物中，并且具有众多生物学功能的酶类其是利用醛类底物氧化生成相应的羧酸的一类酶。他们分为磷酸化和非磷酸化两种，同时生成激活或非激活的两种羧酸产物。所有的醛类脱氢酶都拥有一个共同的催化步骤，即半胱氨酸的巯基基团亲核进攻醛类羰基，再通过水解作用形成相应的羧酸物质，同时伴随着氢离子转移给相应的辅酶NAD(P) 。

乳醛脱氢酶是利用NAD 作为辅酶依赖氧化乳醛生成乳酸。其生理作用为在L-果糖和L-鼠李糖代谢过程中充当一个重要的中间代谢酶。在代谢过程中，L-果糖和L-鼠李糖首先被激酶磷酸化，变成1-磷酸果糖以及1-磷酸鼠李糖，再由6-脱氧己糖酶裂解生成乳醛和磷酸二羟丙酮；最后，乳醛脱氢酶把中间产物乳醛氧化生成乳酸，再经由乳酸脱氢酶氧化成丙酮酸从而进入TCA循环。

大肠杆菌的乳醛脱氢酶（E.C.1.2.1.22)已有研究中发现它有四个明显相等的亚基（每个分子质量为55,000），并且4个NAD同天然的酶的每个分子相结合。只有在有氧的条件下，酶可以被至少三种不同类型的分子所诱导，比如，岩藻糖和鼠李糖，二醇乙二醇和氨基酸谷氨酸。该酶可以用来催化几个醛的不可逆的氧化，在摩尔范围为羟基醛（乙醛，甘油，或乙醇醛）。NAD是优先的辅助因子。酶的功能和结构特征表明，它并不是其他大肠杆菌醛脱氢酶的同工酶，比如甘油醛磷酸脱氢酶，乙醇醛脱氢酶和乙醛脱氢酶。这个酶先前被描述为为乳醛所专用，在醛的氧化中被确认为充当一个普遍的角色，并且它能参与几个代谢的途径。

三、研究内容

本课题以大肠杆菌为表达宿主，首先采用模拟计算得方法，利用可视化软件pymol,amber等进行模拟突变，计算底物乳醛和乳醛脱氢酶结合动态过程的自由能变化，从而选出可能对酶有促进影响的残基位点，再进行试验突变，测定酶活及其相关基本性质如米氏常数，温度稳定性及pH稳定性。

四、研究基础

（1）乳醛脱氢酶的酶活测定方法

NADH的标准曲线：配置不同浓度的NADH（0-1mmol/L）的标准溶液，测定在340nm处的吸光值，制定标准曲线。由标准曲线计算反应消耗或生成NADH的量。

乳醛脱氢酶酶活测定体系：磷酸钠缓冲液中加入终浓度为10 mM的L-乳醛， 2 μL 100 mM NADH，最后加入酶液启动反应，37℃，340 nm处测定（测180 s）吸光值的下降。在37℃ pH 7.0条件下，每分钟氧化1μmol NADH 所需的酶量定义为1 个乳醛脱氢酶的酶活单位。

（2）SDS-PAGE和蛋白含量测定方法

（3）定点突变方法

定点突变采用Stratagene公司的QuikChange Lightning Site-directed Mutagenesis Kit进行突变株的构建。

4）蛋白质计算模拟方法

建立了使用swiss-model建立蛋白模型，Autodock构建酶与底物的结合体，Amber进行底物与酶结合体动力学计算的流程方法。

上述的课题组建立的研究方法及目前课题组取得的科研成果，为本论文的研究奠定了扎实的基础。

五、工作计划

五、参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

一，研究问题

本课题以大肠杆菌为表达宿主，首先采用模拟计算得方法，利用可视化软件pymol,amber等进行模拟突变，计算底物乳醛和乳醛脱氢酶结合动态过程的自由能变化，从而选出可能对酶有促进影响的残基位点，再进行试验突变，测定酶活及其相关基本性质如米氏常数，温度稳定性及ph稳定性。

二，研究手段