摘 要

动物的细胞膜具有选择通透性，有许多用来进行细胞治疗以及研究用的多肽、寡核苷酸和蛋白质等生物活性大分子很难进入细胞内 ，这给生物研究以及细胞治疗增加了几分难度。近些年来，陆续发现了不少可以穿透细胞膜的小分子多肽， 这中小分子多肽被称作细胞跨膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）。CPPs一般是由不超过30个氨基酸残基的多肽构成， 大分子物质可以通过被跨膜肽携带来穿过细胞膜， 同时跨膜肽的跨膜能力强、速度快，对宿主细胞没有明显的毒副作用。

Penetratin是一个由16个氨基酸残基组成跨膜肽，本课题应用多肽固相合成法（SPPS），以Wang树脂为固相载体，运用Fmoc固相合成法来进行合成，从肽的C端向N端合成Penetratin。合成完成后，通过对切割试剂配比、时间和温度的比较得到较优的切割方案。经参考多种实验文献以及考虑到多肽本身的构象问题，通过HPLC、LC-MS对合成获得的Penetratin进行纯度分析与质谱分析，产物确定后通过制备型HPLC进行了纯化制备。

关键词：跨膜肽；Penetratin；固相合成；相互作用

Solid-phase synthesis of penetrating peptides

ABSTRACT

Animal cell membrane has the choice of permeability. Many of the biologically active molecules, such as polypeptide, protein and oligonucleotides ,which are used in cell therapy and research, are hard to get into the cell. It brings some difficulties to biological research and cell therapy. Over the past 20 years, some small molecular peptides with cell membrane penetration ability have been found. These small molecular peptides are called CPPs（cell penetrating peptides）. Polypeptides with no more than 30 amino acid residues constitute CPPs. They carry large molecules to through the cell membrane smoothly, quickly and powerfully and have no significant toxicity to host cells.

In this paper, Solid phase peptide synthesis is introduced at first. Also, the Boc method and Fmoc method are introduced and compared in detail. Penetratin is a penetrating peptides composed of 16 amino acid residues. Penetrain is synthesized from the C side of the penetrating peptides gradually to the N side of the synthesis by basing on the method of solid phase peptide synthesis(SPPS) regarding Wang resin as solid carrier and using Fmoc solid phase synthesis method.After the completion of the synthesis,the better cutting scheme is obtained through comparing the ratio of the cutting reagent, the time and the temperature to distinguish the penetrating peptidess and the resin. The emphasis is on the synthesis of each step.By referencing to a variety of experimental literature and taking the polypeptide conformation into consideration,the essay carries out by HPLC, LC-MS on synthesis to obtain the Penetratin for purity analysis and structure identification.After the product is identified, the preparation of HPLC will be purified by preparative method.

Key Words: penetrating peptides；Penetratin; solid-phase peptide synthesis；interaction

目 录

摘要 I

ABSTRACT i

第一章 文献综述 1

1.1 多肽的固相合成法概述 1

1.2 固相合成法 2

1.2.1 Boc固相合成法 2

1.2.2 Fomc固相合成法 2

1.2.3 两种固相合成法的比较 3

1.3 跨膜肽的研究进展 4

1.4 小结 5

第二章 实验部分 6

2.1 前言 6

2.2 实验仪器及材料 7

2.3 跨膜肽的合成 8

2.3.1 Fmoc-氨基酸与Wang树脂的连接 8

2.3.2 固相上多肽链的延伸 8

2.3.3 反应进程的检测 9

2.3.4 多肽树脂切割 9

第三章 多肽的分析 11

3.1 高效液相色谱分析 11

3.1.1 流动相的配制 11

3.1.2 样品的配制 11

3.1.3 进样分析 11

3.1.4 质谱分析 12

3.2 结果与对比分析 12

3.2.1 质谱分析结果 12

3.2.2 高效液相色谱分析结果 13

3.2.3 两个批次反应实验过程的对比分析 13

3.3 小结 13

第四章 结论与展望 14

4.1 结论 14

4.2 展望 14

参考文献 15

致谢 17

第一章 文献综述

1.1 多肽的固相合成法概述

多肽是通过脱水缩合反应把α-氨基酸以肽键的形式连接在一起从而形成的化合物，一般情况下我们把含有2-6个氨基酸残基的肽片段定义为寡肽，超过6个氨基酸残基的肽片段就称之为多肽，而氨基酸数目为50个及以上的多肽片段则称之为蛋白质。过去大多使用液相合成法来合成多肽片段，但是诸多的副反应是这个方法最大的弊端，直接导致了合成出来的产品有纯化难度特别大等缺点，后来逐渐被Merrifield在1963年发展的固相合成法（Solid-Phase Peptide Synthesis，SPPS）所取代。SPPS在现代作为一种最为常见的方法运用在多肽以及蛋白质合成领域。在1972年Lou Carpino率先开创的Merrifield法是把Fmoc（9-芴甲氧羰基）作为保护基用来当作中的Boc（叔丁羰基）的替代品用来保护氨基酸残基上面的α-氨基，因为Fmoc在碱性条件下易于脱除，同时反应条件比较温和，没有必要像脱Boc-基团那样需要使用三氟乙酸（TFA）来脱除，因此得到了人们的广泛使用^[1]。

固相合成法的主要原理如下：首先把一个具有不溶性的高分子树脂用共价键的方法连接上目标肽链中C末端氨基酸上的羧基（树脂既可以作为载体同时也有保护羧基的功能），与此同时还能够提供保护给那些没必要参与肽键反应的官能团以及活泼的原子^[2]，然后再给羧基进行活化，形成肽键之后再把对应的保护基脱除，重复步骤直至目标肽链全部连接完毕，最后对肽链就行切割以获得树脂^[3]，纯化并且鉴定之后得到目标多肽。固相合成与液相合成有很大的不同，因为固相合成的在每一步化合反应后，仅需要我们简单地并且反复地洗涤树脂数次，即可以完成去除杂质的目的，大大缩短了合成反应的操作流程^[4]。Fmoc合成法以及Boc合成法等固相合成法在近些年都成功地应用到了许多药物的生产之中，例如胸腺素αl（Thyα1），黑色素细胞刺激素（MSH）等这类的活性多肽。。在人们设计以及合成那些医药用途广泛的活性多肽以及研究多肽与生物之间作用机理的时候，固相合成法的迅捷发展起到了举足轻重的地位^[5]。