文 献 综 述

固定化酶技术发展于 20 世纪 60 年代。固定化”immobilized enzyme”这个术语是在1973 年酶工程会议上被正式推荐使用的[1]。Trevan在 1980 年给出了固定化酶的一个意义：酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后成为不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应[2]。 固定化酶与游离酶相比有很多优点，如：①固定化酶与底物、产物极易分离；②可以重复多批次使用；③通常酶的稳定性会在固定化后得到提高；④利用固定化酶反应时可以严格控制反应过程；⑤不会导致酶的残留，简化了后期提纯工艺；⑥与游离酶相比更适合于多酶同时反应；⑦酶的重复性使用更可以降低成本；⑨有些酶的立体选择性和活性会在固定化后得到提高[3]。当然固定化酶也有缺点，如：①酶在固定化时会损失部分酶活；②酶的固定需要载体和设备，增加了生产成本；③只有底物可溶时才适用，而且不太适合作用于大分子底物；④微生物分泌的胞内酶只有在分离后才能进行固定化[3]。虽然固定化酶具有上述缺点，但是固定化酶的众多优点奠定了其工业化应用的重要为位置。固定化技术不仅能稳定酶、改变酶的专一性、提高酶的活力、降低酶的使用成本，而且能够改善酶的各种特性，使之更符合使用要求。但是目前能够投入工业化生产的固定化酶并不多，这是因为固定化过程的成本高，固定化效率低，获得的固定化酶稳定性差，连续操作使用的设备复杂，因此进一步开发更简便、更优的固定化方法和载体材料，使得更多的固定化酶取得工业化的大规模应用，仍然是亟待解决的问题。

石墨烯是目前已知强度最高的材料，只有单原子层厚度的石墨烯具有许多优异的性能，他的出现在 21 世纪初期的科学界掀起了一股研究的热潮。其中，以石墨烯作为增强体制备石墨烯/树脂纳米复合材料是十分引人注目的研究焦点之一，因为石墨烯的引入赋予了树脂基复合材料以出色的力学、热学性能以及光学、电学等功能性。然而，石墨烯的批量制备及其与树脂的亲和性却一直制约着石墨烯在树脂基复合材料中的应用。另一方面，作为继承了石墨烯大部分力学性能的一种重要衍生物，氧化石墨烯凭借着片层表面丰富的含氧官能团和批量制备的简单可操作性，在树脂基复合材料领域引起了极大关注。随着研究的深入，氧化石墨烯的表面状态越来越难以适应日益增长的应用需求，为了进一步获得更高性能的氧化石墨烯/树脂复合材料，需要对氧化石墨烯进行表面修饰以得到更好的界面性能，而官能团的大量存在也为其表面修饰提供了可能。

固定化酶，即用载体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术[4]。自1967年人类首次将固定化氨基酰化酶应用于拆分氨基酸工业以来[4]，有关固定化酶的材料、技术和理论研究得到了迅速发展。近年来，随着有机化学、蛋白质化学、多聚体化学和材料科学的进步，酶的固定化技术更是取得了长足的进步[5]。

酶的传统固定化方法主要包括吸附、交联、包埋和共价结合4种。酶的共价结合固定化方法自20世纪50年代开始盛行，现已成为酶固定化的一种重要方法， 由于其能和酶牢固结合、渗漏量小而备受人们关注。酶和载体的共价结合主要由载体表面的活性功能基团和酶表面的活性氨基酸残基，通过化学反应而结合。为了达到有效的共价连接，必须预先活化载体或酶(通常为载体)上的有关官能团，然后再与酶或载体发生共价结合。因而，载体活性功能基的反应特性会直接影响到酶共价固定的效果。

氨基功能载体通常可以通过如下方法获得：① 利用天然产物经过简单的处理获得，例如甲壳素、壳聚糖等；②直接聚合氨基功能基单体；③先聚合带有惰性基团的单体，之后进行化学修饰；④ 通过化学反应，使其它功能基团转化为氨基功能基等[6]。

在获得氨基功能载体后，通常有3种方法来实现酶的固定化：① 直接将载体与酶通过双官能团或多官能团交联剂交联耦合；② 先活化载体，再固定酶；③先活化酶，再与载体偶联固定。

酶固定化的重要目的就是提高酶的稳定性和延长酶的使用寿命。氨基功能载体在酶的固定化过程中，受载体理化性质、酶与载体结合键数目、酶在载体表面或内部分布等的影响，固定化酶的性能会发生一些有利或不利的改变。因而，在利用氨基功能载体固定化酶过程中，有必要有针对性地合成一些新的氨基功能载体，使其反应条件更温和、酶的固载量更大、酶活力回收率更高、稳定性更强。或者针对特定的载体和酶，通过结合配体、添加稳定剂、固定前修饰、固定后修饰和后固定化技术处理等方法，进一步改善固定化酶的性能[6-10] 。

S一腺苷甲硫氨酸(S#8212;adenosylmethionine，SAM)作为药品和保健品已得到广泛应用[8-9]，其制备方法主要有酵母菌发酵法和体外酶促转化法。与酵母菌发酵法相比，体外酶促转化法合成SAM 具有生产周期短、底物转化率高、纯化工艺简单以及环境友好等优点，具有良好的工业化应用前景[11]。目前，体外酶促转化法合成SAM 需要解决的关键问题是大量廉价SAM 合成酶的获得以及选择合适的载体固定化SAM 合成酶，以大幅提高固定化酶的稳定性和重复使用批次。作者在前期研究中构建了组成型表达SAM 合成酶的重组大肠杆菌[12]，并对SAM 合成酶进行了固定化研究。结果表明，通过海藻酸钙包埋法和壳聚糖一戊二醛交联法得到的固定化酶的机械强度较低，重复使用过程中容易破碎[13-15]。而Luo等[16]使用镍离子亲和层析介质固定的酿酒酵母SAM合成酶也存在酶活力回收率低以及固定化酶重复使用批次少等不足。

氨基树脂作为一种人工合成的多聚物，具有机械强度高、酶载量大等优点，已经被广泛用作固定化酶载体[17-18]。作者使用氨基树脂载体对SAM 合成酶进行了固定化研究，优化了酶的固定化条件并对固定化酶。