文献综述

1.1. 多肽的固相合成法概述

多肽是由α-氨基酸通过脱水缩合形成肽键而连接在一起的化合物，一般文献中定义寡肽是由2-10个氨基酸组成的肽片段，多肽是含10-50个氨基酸的肽片段，蛋白质是含50个氨基酸以上的多肽片段。之前的多肽片段合成是通过液相合成法进行的，但是该方法存在副反应多，合成的产品纯化难度大等缺点，逐渐被Merrifield在1963年发展的固相合成法（Solid-Phase Peptide Synthesis，SPPS）取代。SPPS是现在多肽和蛋白质合成的一种最常见的方法。在1972年Lou Carpino首次用9-芴甲氧羰基（Fmoc）替代Merrifield使用的叔丁羰基（Boc）作为保护基来保护氨基酸残基的α-氨基，由于其易于在碱性条件下脱除，反应条件温和，不必像脱Boc-基团需要用三氟乙酸（TFA）脱除，得到人们的广泛使用 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;Chowlt;/Authorgt;lt;Yeargt;2015lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;19lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[1]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;19lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;19lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;Chow, Hoi Yee, Li, Xuechenlt;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;Development of thiol-independent peptide ligations for protein chemical synthesis. [J]lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;Tetrahedron Letters: International Organ for the Rapid Publication of Preliminary Communications in Organic Chemistrylt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;Tetrahedron Letters: International Organ for the Rapid Publication of Preliminary Communications in Organic Chemistrylt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;datesgt;lt;yeargt;2015lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[1]}。

固相合成法的主要原理是先将目标肽链的C末端的氨基酸的羧基以共价键与一个不溶性的高分子树脂相连（树脂既能作为载体也能保护羧基），同时对于那些不参加肽键形成的活泼的原子或者官能团要进行保护 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;Boll Elt;/Authorgt;lt;Yeargt;2015lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;20lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[2]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;20lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;20lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;Boll E, Drobecq H, Ollivier N, Blanpain A, Raibaut L, Desmet R, Vicogne J, Melnyk Olt;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;One-pot chemical synthesis of small ubiquitin-like modifier protein-peptide conjugates using bis(2-sulfanylethyl)amido peptide latent thioester surrogates. [J]lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;Nat Protoclt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;Nat Protoclt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;datesgt;lt;yeargt;2015lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[2]}，然后再对梭基进行活化，从而形成肽键，再脱除相应的保护基，直到目标肽链全部连接完，最后把肽链从树脂上切下来 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;Keiji Oguralt;/Authorgt;lt;Yeargt;2012lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;3lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[3]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;3lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;3lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;lt;style face='normal' font='Times New Roman' size='12'gt;Keiji Ogura, Akira Shiganaga, Kohji Ebisuno, Hiroko Hirakawa, Akira Otakalt;/stylegt;lt;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;lt;style face='normal' font='default' size='100%'gt;Fmoc-based solid-phasesynthesis of adenylylated peptides using diester-type adenylylated amino acid derivativeslt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;[lt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' size='100%'gt;Jlt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;]lt;/stylegt;lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;Tetrahedron Letterslt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;Tetrahedron Letterslt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;pagesgt;lt;style face='normal' font='default' size='100%'gt;12lt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;-18lt;/stylegt;lt;/pagesgt;lt;volumegt;04lt;/volumegt;lt;datesgt;lt;yeargt;2012lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[3]}，纯化鉴定之后得到目标多肽。与液相合成相比，固相合成在每一步化合反应后，只需要进行简单地反复地洗涤树脂数次，即达到纯化的目的，简化了反应操作步骤 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;黄蓓lt;/Authorgt;lt;Yeargt;2013lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;22lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[4]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;22lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;22lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;黄蓓lt;/stylegt;lt;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;多肽固相合成研究进展[J]lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;河南化工lt;/stylegt;lt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;河南化工lt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;pagesgt;28-30lt;/pagesgt;lt;numbergt;1lt;/numbergt;lt;datesgt;lt;yeargt;2013lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[4]}。近年来Boc合成法和Fmoc合成法等固相合成法己经成功应用到活性多肽药物的生产中，如黑色素细胞刺激素（MSH），胸腺素α_l（Thyα₁）等。SPPS的迅速发展对人们设计合成那些具有医药用途的活性多肽以及研究多肽生物相互作用机理提供方便，发挥了极其重要的作用 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;李燕lt;/Authorgt;lt;Yeargt;2014lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;13lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[5]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;13lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;13lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;李燕,刘晓艳,等lt;/stylegt;lt;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;一种香豆素荧光标记多肽的合成及应用[J]lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;应用化学lt;/stylegt;lt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;应用化学lt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;pagesgt;lt;style face='normal' font='default' size='100%'gt;1413lt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;-1418lt;/stylegt;lt;/pagesgt;lt;numbergt;12lt;/numbergt;lt;datesgt;lt;yeargt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;2014lt;/stylegt;lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[5]}。

1.2. 固相合成法

1.2.1. Boc固相合成法

Boc合成法是以Boc基团作为α-氨基的保护基，一般会选用氯甲基树脂，例如Merrifield树脂，反应过程是将每一个由Boc基团保护的氨基酸以共价键连到树脂上，需要用TFA进行脱保护处理，而一般游离的氨基端用三乙胺中和，活化剂一般选DCC（二环己基碳二亚胺），按顺序把目标序列的氨基酸都连上，最后用HF（氟化氢）或者TFMSA（三氟甲磺酸）把目标多肽从树脂上切除 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;Garnerlt;/Authorgt;lt;Yeargt;2015lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;11lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[6]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;11lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;11lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;Ryan Joseph; Moises Morales Padilla; Philip Garnerlt;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;Solid phase synthesis of ω-aspartic thioacid containing peptides [J]lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;Tetrahedron Letterslt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;Tetrahedron Letterslt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;datesgt;lt;yeargt;2015lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[6]}。

在Boc合成中存在一些不能忽视的缺点 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;Haruna Sugaharalt;/Authorgt;lt;Yeargt;2015lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;14lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[7]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;14lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;14lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;Haruna Sugahara, Koichi Mimuralt;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;Peptide synthesis triggered by comet impacts A possible method for peptide delivery to the early Earth and icy satellites [J]lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;Icaruslt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;Icaruslt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;datesgt;lt;yeargt;2015lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[7]}，由于每合成一个氨基酸都要用强酸进行脱保护，在肽片段与树脂的接头处很容易造成损失，有研究证明如果选用50%TFA脱除Boc保护基，每脱除一次就会有约1.4%的肽片段从树脂上脱落，合成的肽片段越长，损失就越大；另一方面，酸脱保护还会引入一些侧链的副反应，使产品纯度降低；而对酸不稳定的氨基酸如色氨酸等尤其不适合采用Boc合成法 ^{ADDIN EN.CITE lt;EndNotegt;lt;Citegt;lt;Authorgt;C. Flouzatlt;/Authorgt;lt;Yeargt; 1997lt;/Yeargt;lt;RecNumgt;4lt;/RecNumgt;lt;DisplayTextgt;[8]lt;/DisplayTextgt;lt;recordgt;lt;rec-numbergt;4lt;/rec-numbergt;lt;foreign-keysgt;lt;key app='EN' db-id='ewzf52p5mpp990exrf15f5w152w25dsav2vd'gt;4lt;/keygt;lt;key app='ENWeb' db-id=''gt;0lt;/keygt;lt;/foreign-keysgt;lt;ref-type name='Journal Article'gt;17lt;/ref-typegt;lt;contributorsgt;lt;authorsgt;lt;authorgt;C. Flouzat, F. Marguerite, F. Croizet, M. Percebois, A. Monteil, M. Combourieult;/authorgt;lt;/authorsgt;lt;/contributorsgt;lt;titlesgt;lt;titlegt;lt;style face='normal' font='default' size='100%'gt;Solid-Phasesynthesis of ”head-to-side chain” cyclic tripeptides using allyl deprotectionlt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;[lt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' size='100%'gt;Jlt;/stylegt;lt;style face='normal' font='default' charset='134' size='100%'gt;]lt;/stylegt;lt;/titlegt;lt;secondary-titlegt;Tetrahedron Letterslt;/secondary-titlegt;lt;/titlesgt;lt;periodicalgt;lt;full-titlegt;Tetrahedron Letterslt;/full-titlegt;lt;/periodicalgt;lt;pagesgt;1191-1194lt;/pagesgt;lt;volumegt;38lt;/volumegt;lt;datesgt;lt;yeargt; 1997lt;/yeargt;lt;/datesgt;lt;urlsgt;lt;/urlsgt;lt;/recordgt;lt;/Citegt;lt;/EndNotegt;[8]}。

1.2.2. Fomc固相合成法