文 献 综 述

1.1脂肪酶的性质及应用前景

1.1.1脂肪酶的性质

脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)属于羧基酯水解酶类别，脂肪酶能够分步将甘油酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动植物微生物组织中。包括磷酸酯酶，固醇酶和羧酸酯酶。被广泛应用于食品药品皮革和日用化工方面。

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些不溶于水的物类的水解，醇解，酯化，转酯及酯类的逆向合成反应^[1]。脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与PH，温度与PH稳定性，底物特异性等方面脂肪酶的催化特性在于：在油水界面的催化活力是最大的，早在1958年Sarda和Desnnelv就发现了这个现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行的。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征^[2]酯酶作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸形成的酯。

1.1.2脂肪酶的应用前景

脂肪酶的应用是现在生物工程研究领域的大热。随着现代生物技术和计算机技术的快速发展，脂肪酶的研究得到了不断地深入，研究方法和手段也有了很大的提高。现代的计算机技术能对脂肪酶分子的结构进行3D建模模拟分析。脂肪酶尤其以低温脂肪酶备受研究者青睐^[3]，低温脂肪酶都有着接近于自然温度的最适酶反应温度，所以它们能对环境修复起到很大的作用，可用于去除低温状态下工业废物中的油脂还可以处理大量的城市和生活含脂废水和废物。用低温树脂处理这些垃圾是不会造成二次污染且处理效果安全高效^[4]。温脂肪酶具有极高的选择性和专一性，它们还可用于药物的合成及生产，低温脂肪酶的生产不仅能提高手性化合物的产率，还能在一定程度上降低了产生副作用的几率，同时减少了合成时所需的能量^[5]，保证了药品的质量。

1.2多肽树脂的特质及合成

1.2.1多肽树脂特质

多肽类化合物广泛存在于自然界中，在人的生长发育过程中起到了很大的作用，它是涉及于各种生物体中各种细胞功能的生物活性物质。自从人类开始用人工方法来合成多肽以来，多肽伴随着分子生物学，生物化学技术一直处于飞速发展中，取得了很大的进展^[6]。近年来，替代医学，天然药物和自然疗法已开始被西方社会所认识，美国的FDA从1999年就开始允许大豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功能，这使得健康与保健品被人类社会重新认识^[7]。

1.2.2多肽树脂的合成

肽合成主要分为全化学合成和酶促肽键合成。化学合成又分为液相多肽合成和固相多肽合成。近年来的固相多肽合成占了市场的主导地位，这主要是由于他运用了洗涤，过滤等分离提纯技术使得反应的中间体和最终产物比较纯净。

多肽合成的原理是先将多肽中不需要反应的氨基或者羧基用合适的保护基保护，进行偶联反应。肽链如果需要继续的延长^[8]，可以通过适当的试剂选择性的脱去N端或者C端保护基，接下来同新的N端氨基酸或者c保护氨基酸偶联，直至获得目的肽链。

经过多年来的迅猛发展，合成肽的树脂已经有了很多种，根据氨基酸与树脂的连接方式，主要有3种类型：1.以酯键形式和树脂进行连接。2.以酰胺键形式同树脂进行连接，该类树脂主要有MBHA Resin，Knorr Resin等。3.以醇键形式和树脂连接。根据树脂在溶剂中的溶胀性能，又可以把它细分^[9]。

树脂上的固相合成有以下的优点，由于高分子的载体在有机溶剂试剂中仅能溶胀而不会溶解，所以在一系列的高分子化学反应中，树脂与过量的试剂反应后的低分子的副产物等只要使用简单的过滤方法就可以彻底分离，这会给有机合成带来许多的方便。功能基在高分子载体上的分布可以人为地控制，使之稀疏或密集，功能基的稀疏分布有利于提高树脂的功能基容量，提高它的合成效率，在树脂上进行的高分子化学反应，存在着种种奇特的微环境效应，具有较佳的反应选择性和立体选择性。

载体与第一个氨基酸以苄酯键连接时，通常使用有机碱R3N，这可以避免氨基酸的消旋而氨基酸的氨基保护基则使用叔丁基氧羰基^[10]。

1.3脂肪酶的固定化

1.3.1脂肪酶固定化特质

绝大多数的酶在实际工业生产中都有一个致命的缺陷，脂肪酶也不例外，游离的脂肪酶失活很快且难分离回收再利用严重的影响了它的大规模的生产应用，并且酶的价格又过于的高，所以在实际投入工业化生产应用前的方法是采用酶的固定化，将脂肪酶固定在不溶于水的载体上。疏水性基质^[11].可以作为固定化脂肪酶的载体，他能保护脂肪酶高级结构的完整，尤其是脂肪酶还要打开多肽链掩盖活性区域结构来完成催化反应。使用高疏水作为固定脂肪酶的载体，使其稳定性和活性都得到明显的提高^[12]。

所谓固定化脂肪酶就是指带有一定目的的通过化学或者物理方法将酶包裹与聚合物基质中，或者与其他的物质相结合而抑制了酶的移动^[13]，但仍能连续进行催化反应，并且可以重复利用，固定化脂肪酶在许多方面要优于游离酶：可再生利用，在反应器因所需空间小二位置稳定，保留活性，并且有获得超活性的可能。稳定性得到改进，可长时间连续操作。

1.3.2固定化脂肪酶的国内外研究现状

1916年美国的科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象^[14]。自20世纪80年代以来，为了能在实际生产中应用，各个国家的学者努力研究了不溶性固定化酶。不溶性固定化酶不仅具有酶的催化性能，最重要的是它可以重复使用。为的是运用集成度和精密度更高的酶固定化手段^[15]解决了以往靠单一固定方法难以解决的问题。进入了21世纪后，人们又意识到将酶与所选的载体结合并不是酶固定化方法的全部内容。因为固定化处理技术可以充分的提升固定化酶的性能，例如加强多点结合往往能够起到提高酶的稳定性的效果^[16]。

1.4实验室脂肪酶固定化的主要方法

脂肪酶的固定只要有吸附法，共价结合法，交联法，包埋法等。吸附法包括物理吸附和离子吸附, 主要依靠蛋白质和载体间的结合力联结, 作用力较弱, 酶易脱落，载体选择范围较广, 固定化操作过程简单, 吸附法^[17]是经济上最具吸引力的固定化方法。酶蛋白分子上功能基和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接, 结合力牢固, 使用过程中不易发生酶的脱落, 稳定性能好缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂, 反应条件也比较强烈所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶共价结合法是固定化酶研究中最活跃的一类方法。交联法的主要特色是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的交联^[18], 基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键, 得到三向的交联网架结构。多功能试剂制备固定化酶方法可分为: ( 1) 单独与酶作用; ( 2) 辅助蛋白质与酶共存时, 多功能团试剂交联; ( 3) 酶吸附在载体表面上再经受交联; ( 4) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体^[19], 再连接酶最常用的交联试剂是戊二醛。这类方法的优点是酶与载体结合牢固, 不易脱落, 稳定性较高, 试剂价格低廉, 固定化成本低; 缺点是有的方法固定化操作较复杂, 进行化学修饰时, 易造成酶失活, 此类方法是固定化酶研究中最有潜力的方法^[20]。包埋法是一种酶物理包埋在高聚物内, 反应条件温和, 很少改变酶结构的固定化方法。适用于大多数酶、酶制剂及完整的微生物细胞, 但只有小分子的底物和产物条件下适用。 由于采用包埋法固定化酶,酶被完全地限制在微囊或凝胶内, 本身的性能根本不发生变化, 因此, 包埋法是固定化酶研究中最有前景的方法。