1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大豆[glycine max(l.)merr.]是人类植物性蛋白和食用油的主要来源，在我国国民膳食体系中扮演着重要角色。大豆在其生活史中受到多种病虫害的影响，其中大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，smv）引致的病毒病是一种全球性病害，广泛分布于世界各大豆产区，在众多大豆病毒病害中危害最大、影响最为严重。大豆感染smv后，叶面积减少且叶绿素含量明显降低，严重影响植株光合能力，导致大豆植株矮小，生长量降低，单株荚数变少。smv通常可造成大豆减产35-50（ross，1977）^[1]，严重时产量损失在50以上，甚至绝收（liao等，2002）^[2]。智海剑等（1996）^[3]的研究结果表明：13个感病大豆品种在接种smv sa株系后，单株粒重、单株叶面积、茎叶干重、根瘤重、株高、根干重、种子、百粒重、褐斑粒率等8个性状均与对照存在极显著差异；感染smv越早，危害程度越大，籽粒受损越严重。

传统的育种技术在当前大豆病毒防治领域仍然处于主导地位，但其育种周期长。此外，传统的抗病育种依赖于良好的抗源，但由于大豆材料对smv 的抗性具有株系专化性（hayes等，2000^[4]；jagtap等，2011^[5]；kim等，2013^[6]），而smv存在众多株系并且十分复杂，田间的流行的smv也包含smv多个株系。因此传统的育种方法很难在短时间内培育出对smv具有广谱抗性的品种。加之smv变异性极强，传统育种方法培育出的抗病品种容易因smv株系的变化而丧失抗性（steinlage等，2002^[7]；choi等，2005^[8]；koo等，2005^[9]；gagarinova等，2008a^[10]）。

转基因技术可以打破物种间的屏障，在较短时期内完成优良抗性基因的定向改造、重组和转移，能够极大地缩短优良抗病大豆品种的选育进程。1986年，powell 等将烟草花叶病毒（tmv）的cp 基因导入烟草并首次获得了对tmv具有抗性的转基因烟草，这为利用病毒自身基因创制抗病材料提供了新的思路。hinchee等和mccabe等分别利用农杆菌侵染法和基因枪法首次获得了转基因大豆植株，在大豆遗传转化领域取得了突破性进展，使得通过转基因手段培育抗病大豆新种质成为可能。napoli等为了让矮牵牛的花瓣颜色加深，将色素基因chs导人矮牵牛中，紫色非但没有加深，反而变成了白色或者白紫相间，这种现象当时被称为共抑制（co-supression）。直到1998年，fire等通过一系列线虫实验才解释了这种现象，并称之为rna 干扰（rna interference，rnai）。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标和内容

本研究是在高乐和王涛研究基础上进行。高乐以williams82为受体材料，借助转基因手段将smv自身hc-pro基因部分保守片段的反向重复序列导入大豆中，利用已优化的农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系，对受体材料进行转基因实验最终得到对smv具有持久抗性的转基因大豆新材料（携带抗草丁膦除草剂）。王涛对转基因后代材料进行了筛选、鉴定、抗性机理研究、农艺性状分析和转基因后代安全评价。本研究是对t₅代转基因材料进行鉴定、筛选和农艺性状对比分析，旨在对转基因抗病育种技术提供一定的借鉴。

2.2拟解决关键问题

3. 研究的方法与方案

3.1研究方法

3.2.1汁液摩擦接种法繁殖、活化SMV

在南京农业大学牌楼教学实验防虫网室中播种感病大豆品种南农1138-2的种子于沙土盆中，直至第一对真叶完全展开。将保存于-80°C中的SMV-SC3、SMV-SC7、SMV-SC15、SMV-SC18株系取出并放置于冷却的经过高温灭菌的洁净研钵中，加入适量的SMV接种液（0.01 M磷酸缓冲液，约每1 g叶片组织加入3-5 ml缓冲液）以及少量的金刚砂（约600目），在研钵中碾磨成匀浆。然后用经过紫外线灭菌的毛刷将匀浆涂抹至第一对展平的真叶上。防虫温、网室内定期喷施药剂（吡蚜酮）杀灭蚜虫，以防蚜虫传毒造成株系交叉侵染。实验中所用的研钵、研棒以及毛刷均提前用洗洁精清洗干净，研钵、研棒在微波炉中高温杀菌10 min，毛刷放置在消毒柜中紫外线杀菌30 min。接种SMV时，必须佩戴一次性塑料手套；繁殖、活化不同SMV株系时，须更换新手套。

SMV接种液（0.01 M磷酸缓冲液）的配制方法：准确称量35.8 g Na₂HPO₄·12H₂O和3.4 g KH₂PO₄·12H₂O，加纯净水1100 ml并用玻璃棒对其进行搅拌至溶解充分，pH调至7.2，定容至1250 ml。

3.2.2 阳性转基因大豆植株的鉴定

本实验采用除草剂涂抹、PCR扩增检测和PAT/bar转基因检测试纸条三种手段对试验材料进行鉴定，三种检测方法均为阳性的幼苗被认定为阳性转基因大豆植株。

（1）除草剂涂抹

将商用Basta（除草剂）原液用纯水稀释至200 mg/l，加入0.1 Tween-20（表面活性剂）并搅拌均匀。用毛笔蘸取除草剂稀释液，以上表面主叶脉为分界线涂抹植株的半片叶子，另半片叶子作为对照并用记号笔标记。3-5 d后观察叶片症状，如果除草剂涂抹过的半片叶子与对照相比没有发生明显变化，判定为除草剂阳性；如果除草剂涂抹过的半片叶子出现黄化和枯萎等药害症状，判定为除草剂阴性。

（2）PCR检测

采取上述除草剂抗性植株的嫩叶在液氮中碾磨充分，之后利用快捷型DNA提取试剂盒（Tiangen）提取大豆基因组DNA。为了保证CaMV 35S启动子、终止子和RNAi片段（HC-proi）均整合到大豆基因组中，并且以反向重复的形式存在，我们利用引物35S-P、35S-T分别与引物HC-proi-R组合，对上述提取的大豆基因组DNA进行PCR反应；采用Primer Premier 5.0软件设计bar基因的上、下游引物，对上述提取的大豆基因组DNA进行PCR反应。当三对引物均能对大豆基因组DNA扩增出正确的条带时，判定为PCR阳性，否则判定为PCR阴性。

以上述提取的大豆基因组DNA为模板，采用2×Taq MasterMix聚合酶（Tiangen）进行PCR扩增。PCR反应结束后，采用1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的扩增情况。PCR反应程序为：94°C变性5min；94 °C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30 个循环；72°C延伸7min，降至4°C。PCR反应体系如表1所示：

表1大豆基因组PCR扩增体系

（3）PAT/bar转基因检测试纸鉴定

PAT/bar转基因检测试纸（Control line Test line）是在蛋白水平上检测bar基因的表达产物，10min左右即可得到结果，几乎没有污染来源，在三种检测方法中最为可靠，但其成本费用较高。取适量的叶片组织放置于一次性1.5 ml离心管中，将叶片碾碎后加入0.5 ml抽提缓冲液，重复碾碎步骤使样品与缓冲液混合均匀。将试纸条按照箭头的指示方向插入反应管中，10 min后如果试纸条上仅显示出控制线（Control line），判定为阴性；如果试纸条上同时呈现出控制线和检测线（Test line），判定为阳性。

3.2.3 转基因植株田间调查

调查植株第1对至第4对复叶（V₁-V₄）的SMV发病症状，根据4个阶段（V₁-V₄）的发病情况将各个植株划分为4种反应类型，划分标准如表2所示。

表2反应类型划分标准

类型	划分标准
高度抗病（HR）	V1-V4均不发病
延迟抗病(DR)	早期发病，后期SMV症状消失
轻微抗病(MR)	症状延迟出现，或程度轻于对照
感病(S)	V1-V4均发病，程度与对照相同

本研究还对植株花期倒三叶的SMV发病等级进行了调查，倒三叶的平均发病等级代表该植株的病级。根据叶片症状的严重程度，SMV发病等级被划分为5个水平（0-4），划分标准如表3所示。

表3SMV发病等级划分标准

发病等级	划分标准
0	无症状
1	轻花叶
2	花叶
3	皱缩花叶
4	卷曲花叶

3.2.3 qRT-PCR实验检测病毒在转基因植株体内RNA水平的变化趋势

RNA提取（TRIzol法）：

a.操作试验台用75酒精喷施消毒，贴上保鲜膜。将样品组织放入无酶离心管，加入液氮研碎，每100 mg的组织加1 mlTRIzol试剂（用无RNA酶枪头）。

b.将加入TRIzol试剂的样品涡旋震荡1分钟，静置5min。

c.12000r/min离心5min，将上清液倒入新的无酶离心管，加入200ul氯仿，震荡均匀后室温放置15min。

d.4°C，12000r/min离心15min。

e.吸取上层水相至另一无酶离心管（千万不要吸取中间层）。加入500ul异丙醇，混匀，室温放置5-10min。

f.4°C，12000r/min离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

g.加入1ml 75乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；4°C，8000r/min离心5min，弃上清。

h.室温晾干5-10min。（注意：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解）

i.用50ml ddH2O/TE Buffer/0.5 SDS溶解RNA样品，55-60°C水浴5-10min。

j.RNA样品检测：用无菌板加入2-3ulRNA样品和2ul 10×Buffer，用琼脂糖凝胶电泳约8-10min，观察条带。将提取的RNA样品保存于-80°C备用。

qRT-PCR实验操作

采用qRT-PCR技术分析外源基因SMV-CP和bar在转基因大豆W82-HC-1不同组织部位（根、茎、叶、花、荚和种子）转录表达情况。利用Vazyme公司基因组cDNA反转录试剂盒合成cDNA，具体方法如下：在RNase free离心管内加入2ul模板RNA，4×gDNA wiper Mix 2ul，RNase free ddH₂O 4ul，混匀，42°C水浴2min，加入5×HiscriptII qRT SuperMixII 2ul，混匀；逆转录PCR 反应程序：25 °C，10min；50°C，30min；85°C 5min，置于4°C保存。荧光定量20ul PCR反应体系为： 2ul cDNA（逆转录的样品稀释10倍），ChamQ SYBRqPCR Master Mix 10ul，上、下游引物各0.4ul，ddH2O 7.2ul。设置PCR反应（95°C 5 s，59°C 15s，72°C 15 s），40个cycle扩增。在Roche，LC 480II荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR实验，每个样本设置3次重复，数据由荧光定量PCR仪自动读取，采用2^-ΔΔCt法对结果进行相对定量分析，计算目的基因SMV-CP和bar的表达水平。

bar 基因检测引物：

bar-F：5’-CACCATCGTC AACCACTACATC-3’（上游引物）

bar-R：5’-CCCGATGACAGCGACC AC-3’（下游引物）

SMV-CP 基因检测引物：

qRT-CP-F：5’-CAGATGGGCGTGGTTATGA-3’（上游引物）

qRT-CP-R：5’-ACAATGGGTTTCAGCGGATA-3’（下游引物）

大豆看家基因GmTubulin检测引物：

qRT-GmTubulin-F：5’-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3’（上游引物）

qRT-GmTubulin-R：5’-CACTTACGCATCACATAGCA-3’（下游引物）

3.2 技术路线

3.3可行性分析

我国大豆产业面临着严峻挑战。建立高效稳定的大豆转基因体系，加速开发拥有自主产权的转基因大豆新品种，对于发展我国大豆产业、提高国际竞争力具有长远的意义。大豆花叶病毒引致的病毒病是一种全球性病害，它造成大豆大幅减产和品质恶化。传统的抗病育种技术育种周期长且依赖于良好的抗源，但由于大豆材料对SMV 的抗性具有株系专化性，而SMV存在众多株系并且十分复杂，田间的流行的SMV也包含SMV多个株系。因此传统的育种方法很难在短时间内培育出对SMV具有广谱抗性的品种。加之SMV变异性极强，传统育种方法培育出的抗病品种容易因SMV株系的变化而丧失抗性。转基因技术可以打破物种间的屏障，在较短时期内完成优良抗性基因的定向改造、重组和转移，能够极大地缩短优良抗病大豆品种的选育进程。

本研究以Williams82为受体品种的高代转基因大豆品系为实验材料。实验的开展依托南京农业大学国家大豆改良中心和作物遗传与种质创新国家重点实验室，实验条件优越，能够满足实验各个环节的硬件要求。

4. 研究创新点

本研究采用除草剂涂抹、PCR扩增检测和PAT/bar转基因检测试纸条三种手段对以Williams82为受体品种的高代转基因大豆品系进行鉴定，三种检测方法均为阳性的幼苗被认定为阳性转基因大豆植株；通过V1-V4期调查和花期倒三叶病级调查进行大豆花叶病毒抗性筛选，利用qRT-PCR实验检测病毒在转基因植株体内RNA水平的变化趋势；通过调查、考种大豆主要农艺性状并与非转基因对照进行对比分析来评定转基因品系的性状特征及变化。

5. 研究计划与进展

2018.4-5扩繁四个大豆花叶病毒株系sc3/7/15/18，转基因材料及非转基因对照品种播种；

2018.6 对转基因材料及非转基因对照接毒，治理虫菌，取样（qrt-pcr实验），调查v1-v4期，叶片发病情况拍照记录；

2018.7 阳性转基因植株检测（bar试纸条检测、除草剂涂抹和pcr检测），除草剂抗性调查，取样（qrt-pcr实验）；