1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

拟南芥、水稻等植物会受到低温、干旱、高盐等多种非生物胁迫的攻击，粮食安全不断受到挑战，目前的育种方法依赖于寻找相关的抗性基因，但耗时长，抗性易被克服。研究发现，为了抵御这些非生物胁迫，植物进化出small rna，这些srna中有一类微rna(mirna)，其在转录后水平的响应过程中发挥了非常重要的作用，受到全球研究人员关注。近年来，分子克隆和功能注释加深了我们对mirna的理解，并且作为最终目标之一，许多研究工作者都致力于全面了解植物中mirna介导的基因调控网络。

mirna是真核生物和部分病毒体内普遍存在的长度约为21-24nt的内源性非编码单链小分子rna。在植物中，内源mirna基因在rna聚合酶Ⅱ的作用下转录生成初级(pri-mirna)，在dicer的同源异形体dcl1及其辅助因子hyl1的作用下，被切割形成约60～70nt具有茎环结构的前体mirna(pre-mirna)。pre-mirna在转运蛋白5(exportin-5)的作用下进入细胞质，随后被rna酶Ⅲ切除环状部分，产生约16～29bp的mirna/mirna^*双链rna。该杂合双链rna会与rna诱导的沉默复合体中的ago蛋白结合，mirna^*随后会被降解，而另一条链即为成熟的mirna单链。该单链通过与其靶mrna靶位点的互补结合，降解靶mrna或抑制靶mrna的翻译从而调控内源基因的表达，进而调控植物新陈代谢、组织生长、繁殖发育、凋亡等整个生命过程。当mirna与靶mrna完全互补或近完全互补时，在mirna第10或11位碱基处精确切割并降解靶mrna，这是植物mirna介导靶mrna的主要作用方式；当mirna与靶mrna不完全互补时，则会抑制靶mrna的翻译，而不降解靶mrna，例如，拟南芥mir172与其靶基因ap2 mrna高度互补，并且它抑制ap2蛋白的表达，但未检测到ap2 mrna表达的降低。自从lee最早在秀丽隐杆线虫中发现mirna以来，利用直接克隆测序和生物信息学等方法在拟南芥、水稻、大豆、玉米等许多高等植物中也发现了大量的mirna，其中也包括很多与植物非生物胁迫（如低温、干旱等）响应相关的mirna。以下通过土壤盐度、低温、干旱等方面，简要说明mirna响应逆境胁迫的机制。

土壤盐度是农作物生长的重要限制因素，首先，盐胁迫会破坏植物细胞细胞膜、光合膜结构等，从而影响植物细胞正常的稳定状态和植物的光合作用呼吸作用，最终导致农作物减产，甚至绝收。近年来通过对逆境响应mirna的研究，鉴定了一些盐胁迫响应mirna。如大豆mirna172a通过切割降解靶基因ssaci解除其蛋白对硫胺素前体合成酶基因thi1启动子的抑制作用，从而促进thi1表达，提高硫胺素合成量，进而促进大豆的耐盐性；拟南芥mir397在高盐条件下上调表达，导致lacs和ckb3-mrna的表达水平下降，使得转mir397基因的拟南芥植株的抗盐性有所提高，相反，对mir397具有抗性的转基因拟南芥植株的耐盐能力有所减弱；liu等借助芯片杂交在拟南芥中鉴定了mir396和mir168等12种盐胁迫诱导表达mirna。在极端盐胁迫的条件下，不同的mirna在改变植物耐盐能力的过程中发挥着不同的作用，部分mirna可以通过上调靶基因的表达来改变植物体中某些化合物的含量以及植物的某些代谢途径从而提高植物耐盐性，同一种mirna在不同的植物中的表达也存在着很大的差异性从而对植物耐盐性能的改变产生不同的作用。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

（1）利用水稻、拟南芥的基因芯片数据，筛选出胁迫相关的差异表达基因；

（2）筛选出与低温、干旱、高盐三种胁迫相关的mirna并构建调节网络；

3. 研究的方法与方案

研究方法：

（1）数据来源：从ncbi的geo(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)数据库下载水稻、拟南芥低温、干旱、高盐三种胁迫条件下的基因芯片数据。从实验室网页dpmind(http://cbi.njau.edu.cn/dpmind/)下载水稻、拟南芥所有已知的mirna的降解组验证数据。从ncbi的geo数据库下载水稻低温、干旱、高盐条件下mirna测序数据。

（2）胁迫相关靶基因的鉴定：利用r语言编写t-test程序计算p值，筛选胁迫相关靶基因（p0.05）。

4. 研究创新点

之前对于miRNA参与植物抗逆性的研究，均以差异表达miRNA为出发点，忽略了本身在胁迫条件下变化不明显，但也与胁迫相关的miRNA的作用。因此，本项目将通过分析水稻、拟南芥植物胁迫条件下的差异表达基因，从而分析胁迫相关的miRNA。此外，本项目创新性地利用超几何分布方法，通过生物信息学技术研究胁迫相关miRNA并构建分子调控网络，对于进一步理解miRNA在胁迫响应过程中的功能具有重要的意义。

5. 研究计划与进展

2018.7-2018.8准备所需数据，编写计算p-value的t-test和超几何分布脚本程序；

2018.9完成基因芯片数据的差异表达分析和超几何分布分析；

2018.10构建低温、干旱、高盐三种胁迫条件下的mirna调控网络；