1. 研究目的与意义

蚕豆微核检测技术已被广泛运用于各类污染物以及诱变剂的检测，在各种各样的生物化学研究中扮演者重要角色。微核（mcn,micronucleus）是位于细胞质内独立于细胞核主核的一团由遗传物质聚集而成的椭圆状微小核，其体积约为细胞核的1/20~1/3。当细胞受到外界的毒害时，染色体发生断裂使染色体在有丝分裂时期不能进入子细胞，从而形成微核。其应用范围广泛，为对遗传物质具有损伤作用的射线及化学物质的检测作出了巨大贡献。由于植物细胞对致突变物的反应上与高等哺乳动物相似的多，因此具有很高的可靠性；另外，检测成本低廉，这对于诱变剂的检测是至关重要的。但是也具有一定局限性，例如缺少动物中的代谢系统、无法显示诱变机制、微核计数会不准确等。因此，在此实验中也应当选择合理的条件。^【1】

香烟是一种被证明具有强烈致癌性的产品，但同时也受大多数人民的喜爱，由于香烟中的主要成分尼古丁是一种具有强烈成瘾性的物质，且能起到提神和止痛的效果，因此尽管人们都知道吸烟的危害但戒烟也是一件很难的事。据统计，每年50-54岁的男性人群中，在美国的患肺癌率约为每100000个人中有100个；在英国，每100000个中大约有120个；而在瑞典仅28.6；柬埔寨为16.9。^【2】吸烟除会提高肺癌的发病率外，还会引发多种其它疾病，降低人体抵抗力，在香烟中含有3500多种致癌物，且这些物质互相之间具有协同效应，而香烟中的主要成分为尼古丁和焦油，其诱变机制尚不清楚，但是若能从其中一种物质展开研究，深入探究其诱变性，并通过微核技术检测出诱变性的强弱以及对该诱变具有拮抗作用的物质，便能使得吸烟的危害减少初步成为可能。

对于杉科珍稀植物的研究现国外已作出分类，分布以及以及化学成分的归纳分析以及在开发利用过程中的问题进行探讨并制定适宜的方案。从中检测出数百种化学成分，在药理学分析过程中发现，具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等功效。我国主要生产紫杉醇的植物树种为云南红豆杉，经测定的数据分析，云南红豆杉是紫杉醇、以及半合成原料（10-去乙酰巴卡亭iii和巴卡亭）含量最高的树种。据统

2. 研究内容和预期目标

研究内容：

1.自然条件下选择生长状况相似的蚕豆观察蚕豆的微核率

2.自然条件用不同的生长状况的蚕豆观察微核率的差异

3. 研究的方法与步骤

一、香烟中有害物质尼古丁的提取（水蒸气蒸馏法）

实验原理

烟草中含有多种生物碱，除主要成分烟碱（约含2 ~ 8 %）外，还含有去甲烟碱、假木烟碱和多种微量的生物碱。烟碱又名尼古丁，是由吡啶和吡咯两种杂环组成的含氮碱，其结构式如右图：

烟碱能与HCl结合生成烟碱盐酸盐（弱碱强酸盐）而溶于水中，在此提取液中加入强碱NaOH后，可使烟碱游离出来。

由烟碱的结构可知，烟碱具有碱性，它不仅可以使红色石蕊变蓝，还可以使酚酞试剂变红，并可以被KMnO₄溶液氧化生成烟酸，与生物碱试剂作用产生沉淀。

实验仪器与试剂

1. 仪器

长颈圆底烧瓶、圆底烧瓶、直形冷凝管、电热套、玻璃棒、试管、止水夹、蒸汽导管、烧杯、球形冷凝管、接液管、T形管、滴管、洒精灯、锥形瓶、量筒

2.材料与试剂

烟叶、HCl溶液10 %、NaOH 40 %、KMnO₄0.1 %、酚酞 0.1 %、Na₂CO₃5 %、苦味酸

3. 其它

红色石蕊试纸、沸石

实验内容

1、烟碱的提取

取一支烟，拨去外纸，将烟丝置于100 mL圆底烧瓶内，加入20 mL10％HCl溶液，安装好回流装置，回流20 min，将反应化合物冷却至室温，在不断搅拌下慢慢滴加40％NaOH溶液，使之呈明显碱性（用红色石蕊试纸检验）。

安装好水蒸汽蒸馏装置。通入冷却水后，用电热套加热水蒸汽发生器，当有大量水蒸汽产生时，关闭T形管上的止水夹。

收集约10 mL提取液后，先打开止水夹，再停止加热^[2]。待体系稍冷却，关闭冷却水。

2、烟碱的性质检验

（1）碱性试验：取10滴烟碱提取液，加入1滴0.1%酚酞试剂，振摇并观察现象。另取1滴烟碱提取液在红色石蕊试纸上，观察试纸的颜色变化。解释上述现象。

（2）氧化反应：取20滴烟碱提取液加入1滴0.1％KMnO₄溶液和3滴5％Na₂CO₃溶液，摇动试管，于酒精灯上微热，观察颜色是否变化，有无沉淀生成。

（3）与生物碱的反应：取10滴烟碱提取液，逐滴加入饱和苦味酸，边加边摇动，观察有无黄色沉淀生成。

结果与分析

二、蚕豆的浸种、培养及生长状况的记录

材料与试剂

蚕豆为当年生无虫饱满，大小均一蚕豆种子，6mol/L盐酸，甲醇，醋酸洋红，CrO3,NaN3处理液，甲基磺酸乙酯（EMS），蒸馏水，冰醋酸，卡诺氏固定液，乙酸乙酯

显微镜，计数器，镊子，载玻片，盖玻片，烧杯，磁盘，培养箱，分析天平，水浴锅，酒精灯，剪刀，解剖针，滤纸，铅笔，标签纸，胶水等。

实验步骤

浸种催芽 选择粒大饱满、大小均匀的蚕豆种子按需要量放入盛有自来水的烧杯中 ,在 25 ℃下浸泡 24 h, 期间至少换水 2 次。 种子吸胀后 , 用纱布松散后裹置瓷盘中 , 保持湿度 ,在25 ℃恒温培养箱中催芽12 ～ 24 h , 待初生根长2～ 3mm，取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中25 ℃继续催芽，经约36 ～ 48 h, 大部分初生根长至 1 ～ 2cm，根毛发育良好，这时即可用于检测了。

二、蚕豆根尖制片（阴性对照、阳性对照、实验组）

诱变剂处理

取诱变剂用蒸馏水配置成不同浓度的溶液，浓度为0.25mg.mL-1；取适量体积置于培养皿中用于处理蚕豆根尖。取和诱变剂等体积的自来水处理蚕豆根尖，作阴性对照，用0.25mg／L叠氮化钠作阳性对照。当初生根长到2～3cm时，各选初生根生长良好的蚕豆6～8粒，分别放入四个培养皿中中，染色24～27h。

恢复培养处理后的种子用自来水和蒸馏水共浸洗 3 ～ 5 次 , 每次 2 ～ 3 min，洗净后，再置入铺有湿润滤纸的瓷盘中中,25 ℃恢复培养 22 ～ 24 h 。

取材、固定将恢复培养后的种子，从根尖顶端，切下1cm长的幼根。用卡诺氏液固定24h。

解离、制片观察 用蒸馏水浸洗两次，每次5min，吸干，加入6mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10min，幼根软化即可。吸取盐酸，用蒸馏水浸洗三次，每次1～2min，最后浸于水中；取根置于载玻片上，截下1～2mm长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色5～8min，加盖玻片压片观察。

微核计数 微核是游离于蚕豆根尖细胞浆中圆形或椭圆形小体．其太小不超过主核1／3，染色性与主核相一致。每组随机取3个根尖，高倍镜观察l000个间期细胞，统计徽核数及徽核率，然后用方差分析做统计学处理。

四、统计与数据分析

利用 S P S S 软件对实验结果进行数据分析。应用 Independent-samples T Test 分析各处理与对照间的差异性。首先进行等方差检验，当其概率值大于 0 . 0 5 时， 表明为齐性方差，否则为非齐性方差。由对应的t值及相应的概率值确定差异的显著性。 以不同体积的尼古丁对蚕豆根尖细胞进行处理，观察其结果，对实验结果进行方差分析，得到F 检验的结果，计算分裂指数。不同体积的尼古丁处理蚕豆根尖，P 值小于 0.01，说明各处理与对照间差异 极显著；P 值大于0.05，说明各处理与对照间无显著差异。

4. 参考文献

参考文献

[1]李爱玲，贾盼.蚕豆根尖微核检测技术的应用与发展[j].陕西农业科学2014，60（5）：66-68.

[2]王达明，周云，李连芳.云南红豆杉抗癌要用成分的含量[j].西北林业科学2004，33（3）：12-17.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周（2022-3-1），接受任务书。查阅资料，确定所选香烟样品以及杉科植物，准备开题报告，外文论文翻译。

（2）第2周~第4周（2022-3-02~3-23）综合相关文献资料，撰写开题报告完成后在系统中提交，设计微核实验方案并准备预试验。

（3）第5周~第12周（2022-3-24~5-18）香烟有害成分提取方法选择、确定和收集；处理蚕豆根尖方法优化。蚕豆微核技术考查不同香烟样品的诱变作用以及杉科植物拮抗等预实验数据整理。优化实验方案，正式实验和必要的重复。比较所得数据，发现所选样品对香烟遗传毒性的影响强度。