1. 研究目的与意义

手性是自然界一种普遍存在的现象，组成生物体的重要分子多为手性物质，如氨基酸、糖、蛋白质以及核酸等，然而实际上他们多以单一对映体形式存在。目前市售药物中手性药物占了很大一部分，在疾病治疗中单一对映体手性药物分子与体内大分子选择性结合，产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，可能从而具有不同的药理活性、代谢动力学特征和毒性差异。

外消旋化合物的手性分离是获得单一对映体的方法之一。随着对手性药物用药安全性的不断关注，开发单一对映体的手性药物成为国际临床药物评价和研究领域中令人瞩目的前沿课题。而开发单一构型的手性药物，首先要建立快速、准确的对映体分离分析方法。高效液相色谱法(HPLC)被公认为是一种强大、快速、高效的分离技术，它已成功应用于对映体药物的分离分析和制备中。HPLC用于对手性药物分离的研究已取得很大进展，并且研发了大量可应用于手性小分子和聚合物分离的手性固定相，大大提高HPLC的手性识别能力。

2. 课题关键问题和重难点

1.柱压问题所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在345kPa以内 (在使用梯度洗脱时,柱压平稳、缓慢的变化是允许的）；2.基线不稳定 色谱曲线在较长时间范围内对响应值的0刻度较大的偏离，通常包括基线漂移（单方向）、基线起伏（规律的上下起伏）、区域宽度极大的色谱峰三种情况；3.保留时间重现性差 当保留时间的偏差超过2%，可以认为保留时间的重现性差。对于某一个特定的分析，保留时间主要受流动相组成、流速、温度以及固定相影响； 4. 峰形不理想 理想的色谱峰遵循正态分布，应该符合高斯曲线，是完美而对称的峰形；然而由于化合物性质的特殊性、色谱柱故障、操作条件等问题存在，峰形可能会不对称。难点：用什么操作方法去改善峰型和稳定好保留时间，来达到最好的分离效果。

3. 国内外研究现状（文献综述）

摘要：目的：建立HPLC法测定D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇中对映异构体含量。方法:色谱条件流动相：正己烷-乙醇-异丙醇；色谱柱：Chiralcel IC柱（4.6250mm,5μm）；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：240 nm；柱温:37℃；进样量:20μL。结果：方法专属性强、灵敏度高、耐用性好。结论:建立的D-( )-二对甲基苯甲酰酒石酸中对映异构体含量的分析方法，可用于该化合物及对映体的手性纯度测定。

关键词：D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇；高效液相色谱法；手性色谱柱；对映异构体

Determination of enantiomers of chiral compounds by high performance liquid chromatography

Abstract：Objective:To establish the method for determination of enantiomers in D - (-) Sue - nitro phenyl - to 2 - amino - 1, 3 - propanediol enantiomorphism isomers by HPLC. Methods: Chromatographyconditions: Mobile phase: hexane- methanol-IPA. Columns: ChiralpakIC column（4.6250mm,5μm）The flow rate of mobile phase was 1.0mL/min. Theabsorbancewavelengthwascarriedoutat240nm. The column temperature was carried out at 37℃ and the injection volume was 20μL. Results: Method is specific,sensitive and good durability. Conclusion: The established method for determination of enantiomers in D - (-) Sue - nitro phenyl - to 2 - amino - 1, 3 - propanediol enantiomorphism isomers can be used forboth of compounds and enantiomerschiral purity test.

Keywords：D - (-) Sue - nitro phenyl - to 2 - amino - 1, 3 - propanediol enantiomorphism isomers；HPLC；Chiral column；enantiomers

前言

手性是自然界一种普遍存在的现象，组成生物体的重要分子多为手性物质，如氨基酸、糖、蛋白质以及核酸等，然而实际上他们多以单一对映体形式存在。目前市售药物中手性药物占了很大一部分，在疾病治疗中单一对映体手性药物分子与体内大分子选择性结合，产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，可能从而具有不同的药理活性、代谢动力学特征和毒性差异。

大致可分为以下四类：（1）对映体之间有相同或相近的某一活性，如噻吗洛尔两个对映体都具有降低眼压治疗青光眼的作用；抗凝血药华法林和 β-肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔；（2）一个对映体具有显著的活性但其对映体活性很低或无活性，如抗菌药氧氟沙星S-(-)-异构体是抗菌活性体，而 R-( )-异构体则无活性；（3）对映体有相同、但强弱程度不同的同一活性， 例如S-氯胺酮的麻醉镇痛作用是R-氯胺酮的1／3，但致幻作用较R型强；抗癌药环磷酰胺其(S)-异构体活性是(R)-异构体的2倍；（4）对映体具有不同性质的药理活性，如丙氧芬的右旋体(2S，3R)为镇痛药，但左旋体(2R，3S)具有镇咳作用。

随着对手性药物用药安全性的不断关注，开发单一对映体的手性药物成为国际临床药物评价和研究领域中令人瞩目的前沿课题。而开发单一构型的手性药物，首先要建立快速、准确的对映体分离分析方法。气相色谱法（GC）、超临界流体色谱法（SFC）、毛细管电泳（CE）和毛细管电色谱（CEC）等都可用来分析对映体，而高效液相色谱法（HPLC）因其独特的优势成为手性分析中最常用的一种技术。高效液相色谱法分析手性药物分为直接法和间接法两种，前者包括手性固定相法（CSP）和手性流动相添加剂法（CMPA），后者即为手性衍生化试剂法（CDR）。其中手性固定相法具有简单、快速、可靠、准确度高、分离效果好的优点，所以此法拆分手性药物及中间体对映体应用最为广泛。主要的手性固定相有多糖衍生物类手性固定相、环糊精类手性固定相、蛋白质类手性固定相等。其中多糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱（Chiralpak IC柱、Chiralpak IA柱）具有溶剂使用无限制、高分离能力、使用寿命长，可修复再生等优点；多糖衍生物涂敷型手性色谱柱（Chiralcel OD柱、Chiralcel OJ柱和Chiralpak AY柱）具有适用范围广、适合在正相流动相中使用，载样量大等优点，故二者常用于含有：酰胺基、芳香环取代基、羰基硝基、磺酰基、氰基、羟基、氨基等基因化合物，以及氨基衍生物等化合物的拆分。

手性拆分剂D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇及其对映异构体由于其价格低廉，性质稳定，易于回收利用等特点被广泛用于有机胺类的拆分，具有很好的工业应用价值。常用的旋光仪检测光学纯度，由于受多种因素的影响，有时测定值会出现严重误差。而高效液相色谱法具有高效、快速，准确的特点，不仅可以用于检测，也可用于对映异构体的制备。因此，本课题试图通过考察D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇及其对映体在七种常见手性色谱柱（Chiralpak IC柱、Chiralpak IA柱、Chiralcel OD-H柱、Chiralcel OJ-H柱、Chiralpak AY-H柱、Chiralpak AD-H柱、Chiralpak AS-H柱）上的分离趋势和保留顺序，以及流动相成分比例对洗脱顺序、分离度和峰形的影响，以期实现建立对手性拆分剂D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇及其对映异构体专属性强，灵敏度高的分离和手性纯度测定方法。

第一章 D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇的比旋光度测定

1.1 实验部分

D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇（化合物A,见图1）及其对映异构体（1S，2S）-氨基-1-（4-硝基苯基）丙烷-1，3-二醇（化合物B，见图2）是一种广泛用于胺类化合物拆分的手性拆分剂。通过查阅资料得知该对映体为白色或微黄色无定形结晶性粉末，极微溶于水，微溶于甲醇及乙醇。熔点为163-165℃，有2个确定的原子立构中心，D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇[α]=-22.50（c=0.430，in EtOH）。故采用乙醇为溶剂，旋光仪初步测定其比旋光度。

1.1.1 实验药品和试剂

1.1.2 主要仪器

1.1.3 溶液配制

单一手性异构体溶液的配制：取化合物A和化合物B各约 43mg和53mg，精密称定，分别置于10ml棕色容量瓶内，加入10ml乙醇超声溶解后，再用乙醇稀释至刻度，摇匀。

1.1.4 仪器条件

1.2 结果与讨论

1.2.1 实验结果

1.2.2 实验小结

本章对D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇及其对映异构体的进行了初步的比旋光度测定，根据实验结果化合物A的[α]为-22.50，与资料查阅结果（1S，2S）-氨基-1-（4-硝基苯基）丙烷-1，3-二醇[α]=21.51接近，初步估算其光学纯度为104.6%。下章将用HPLC法对化合物A和化合物B的混合消旋体进行分离分析。

第二章 D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇的手性纯度测定

2.1 HPLC法色谱条件的建立

由于D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇（化合物 A ）中具有苯环取代基、硝基和羟基结构，可能与多糖类衍生物作用，从而实现异构体分离。本实验考察了药石公司自己研发的一组化合物D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇及其对映异构体在最常见的七种手性固定相（Chiralpak IC柱、Chiralpak IA柱、Chiralcel OD-H柱、Chiralcel OJ-H柱、Chiralpak AY-H柱、Chiralpak AD-H柱、Chiralpak AS-H柱）上的分离情况，并且选择分离后出峰效果最好的方案，在这基础上改变条件优化方案建立了直接对混合对映体同时分离和分析的正相高效液相色谱法。

2.1.1仪器与试剂

2.1.2 检测波长的选择

2.1.3 固定相的选择

2.1.4 流动相的选择

2.2样品测定

总结

本实验通过考察D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇及其对映异构体在手性色谱柱上的分离趋势和保留顺序，及流动相成分对色谱峰的影响，建立了D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇与其对映异构体的分离条件。确定了以Chiralpak IC柱为分析柱，正己烷-乙醇-异丙醇为流动相，流速为1ml/min，检测波长为240nm，柱温37℃，进样量20μL，以正己烷-乙醇（80/20，v/v）为溶剂，样品浓度为250μg/ml的条件下，D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇与其对映异构体可达到完全分离。且该方法不仅可以用于D-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇的手性纯度测定，也可用于（1S，2S）-氨基-1-（4-硝基苯基）丙烷-1，3-二醇的手性纯度测定。

参考文献

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[5]邹卫. 手性固定相高效液相色谱法拆分药物中间体对映体[D]. 重庆医科大学, 2011.

[6]梁晓梅, 吴景平, 王京辉,等. 高效液相色谱法测定布诺酚的光学纯度[J]. 色谱, 1997(5):435-437.

4. 研究方案

通过搜集资料并查阅大量文献，并仔细阅读文献来了解相关的课题知识与背景，对本课题制定以下研究方案：

一、本实验考察了药石公司自己研发的一组化合物d-(-)苏-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇及其对映异构体在最常见的七种手性固定相（chiralpak ic柱、chiralpak ia柱、chiralcel od-h柱、chiralcel oj-h柱、chiralpak ay-h柱、chiralpak ad-h柱、chiralpak as-h柱）上的分离情况；

二、设计优化方案，改变优化条件；

5. 工作计划

计划在每周完成如下内容：

第一学期

第 16-18周 确定毕业论文题目，查阅相关文献资料，写好任务书。