1. 研究目的与意义

1.1 研究意义

近年来的研究发现小分子rna（small rna, srna）尤其是microrna，在植物激素应答通路中担任着重要的调控角色，它们通过调节靶基因的表达实现对植物激素在代谢、分布以及含量等方面的控制，形成了一个由srna、靶基因、植物激素三者组成的生长发育调控网络。

水稻不仅是世界上最重要的粮食作物之一而且是单子叶模式植物，植物激素作为植物生长发育过程中的信号因子，调控着其中各个阶段基因的表达，例如赤霉素、生长素、细胞分裂素等植物激素就几乎参与了水稻生长发育的整个过程，对水稻的形态建成、逆境抗性以及产量构成等都具有重要影响。但目前还不能控制激素对生长发育的作用，这主要是由于水稻中激素信号通路的分子机制仍然不够完善，尤其是在小rna的调控方面，因此阐明小rna对植物激素信号通路的调节机制显得十分必要。

2. 研究内容和预期目标

2.1 研究目标

本研究以赤霉素为切入点，对水稻响应赤霉素的小rna进行鉴定与分析，为阐明小rna对赤霉素信号通路的调节机制打下研究基础。

2.2 研究内容

3. 研究的方法与步骤

3.1 研究方法

1. Small RNA测序数据质量检测法

通过FastQC对small RNA进行质量检测，设计脚本过滤低质量测序数据，使较高质量测序结果被保留。

2. 同源序列比对法鉴定miRNA

在建立好的已公布水稻miRNA数据库的基础上利用短序列比对工具Bowtie1等鉴定出已知的miRNA，利用miRDP软件包基于同源序列比对法鉴定出新的miRNA。

3. 表达差异分析法

采取基于t-test的DESeq法和P值筛选法倍数法两种表达差异分析法，结合两种方法的结果。

4. psRNATarget网站靶基因预测

psRNATarget网站是针对植物miRNA靶基因预测较为权威的网站，基于同源序列配对法预测靶基因。

5. 降解组数据验证法

降解组测序数据可以帮助验证miRNA与其预测的靶基因之间有否联系，通过设计脚本来评估靶基因预测结果，以便于筛选可靠性高的靶基因。

6. 荧光定量PCR验证法

荧光定量PCR可以实现精确定量，通过比较赤霉素处理不同时间的水稻幼苗，由此验证miRNA和靶基因有否存在差异表达。

7. 靶基因富集分析法

通过基因本体、代谢通路等富集分析以预测miRNA靶基因的生物功能。

8. Cytoscape网络构建法

构建miRNA-靶基因-生物功能的网络图，使miRNA的作用机制具象化、可视化。

3.2 技术路线

赤霉素处理水稻

Small RNA测序数据

质量检测

比对基因组

比对上的Small RNA

鉴定已知的miRNA

预测新的miRNA

差异表达分析

差异表达miRNA

靶基因预测

降解组验证

qRT-PCR验证

富集分析

构建互作 网路图

3.3 实验方案

1. miRNA鉴定

筛选已知miRNA：在miRBase(http://mirbase.org/index.shtml)数据库上下载已经公布的水稻成熟miRNA以及miRNA前体数据，将small RNA测序数据分别比对水稻基因组、成熟miRNA和miRNA前体，设计脚本筛选出已知的miRNA。

预测新的miRNA：以成功比对水稻基因组但未匹配已知miRNA的small RNA数据文件为基础，利用miRDP软件包截取比对上基因组部分上下游一定长度作为miRNA前体进行折叠和参数分析，最终预测出水稻新的miRNA。

2. 差异表达分析

P值筛选法倍数法分析：首先对赤霉素处理和空白对照的small RNA数据中的miRNA进行表达量提取，鉴于t-test统计假设测验筛选出P值达到5%的显著性差异临界值的miRNA，设计脚本使其表达量倍数化，最后筛选出差异表达的miRNA。

DESeq法分析：在R语言脚本下运行DESeq软件包，对处理和对照表达量数据进行基于t-test统计分析，所运行结果的作为参考。

3. miRNA靶基因及生物功能预测

利用psRNATarget网站进行miRNA靶基因预测；生物功能预测采用了靶基因富集分析法进行，富集分析包括了基因本体、mapman和KEGG数据库代谢通路富集分析，基因本体和KEGG代谢通路富集分析采取在线形式分析，mapman代谢通路富集分析采取本地分析。

4. 实验验证

降解组测序数据验证：设计脚本比对靶基因预测结果与降解组测序数据结果，评估预测结果的可靠性并进行分类，最后筛选出可靠性较高的预测结果。

qRT-PCR实验验证：基于实时荧光定量PCR的精确定量分析，对经过赤霉素处理不同时间长度的水稻幼苗进行分析，以验证生物信息学分析的差异表达是否准确。RNA提取之后，鉴于miRNA长度较短需要采取茎环引物设计法进行反转录。荧光定量PCR不仅可以获得miRNA的表达差异，还可以获取miRNA靶基因的表达情况，为进一步研究靶基因的生物功能提供数据基础。

3.4 可行性分析

目前导师课题组在small RNA的研究方面已经较为成熟，不仅可以提供small RNA生物信息学分析的常用脚本，还能够提供脚本语言的学习方法，在对脚本语言有一定认识的基础上我能够修改、设计脚本以便于分析水稻响应赤霉素的small RNA。水稻作为重要的粮食作物和单子叶模式植物具有重要的研究意义，在植物激素方面已有较深厚的研究基础，目前水稻的基因组、转录组、代谢组等数据库也已较为完善，为本课题的研究提供了巨大的便利。因此本课题研究水稻响应赤霉素的小RNA鉴定与分析是可行的。

4. 参考文献

本研究首次采取小RNA测序数据和降解组测序数据对水稻响应赤霉素的小RNA进行鉴定和分析，通过生物信息学方法预测出小RNA-赤霉素-生物功能的调控网络，并辅以荧光定量PCR实验对预测结果进行评估验证，为阐明小RNA对赤霉素信号通路的调节机制打下基础。

5. 计划与进度安排