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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、课题意义 茶树(Camellia Sinensis)是中国、日本、印度和肯尼亚等30多个国家的重要作物。除水外，茶叶通常用来制作消费最广泛的饮料。由茶叶制成的饮料具有独特的口味和风味，并具有健康益处，因为茶叶中含有多酚、咖啡因、氨基酸、芳香化合物、维生素和碳水化合物。[1-3]茶树最常用的部分是叶子，因此，人们对茶花的关注较少。自从无性繁殖在茶树上应用以来，茶花已成为一种“浪费资源”，与茶叶争夺水和养分。为了提高茶叶的产量和品质，一些化学物质，如乙烯利和α-萘乙酸，常在9-12月份被用来抑制茶树开花。[4]茶花含有与茶叶相似的具有代表性的代谢物，如儿茶素、黄酮醇、咖啡因和氨基酸。茶花中的优势功能分子包括皂甙、多糖、芳香化合物、亚精胺衍生物和功能蛋白。茶花中存在多种功能代谢产物如儿茶素、多糖和皂甙，这些产物说明茶花具有多种生物学功能。[5]2、国内外研究进展 大量的体内外研究报告了茶叶及其儿茶素的有益健康特性。[1,2]八种单体儿茶素，儿茶素、表儿茶素、半乳糖儿茶素，表没食子儿茶素（EGC）、没食子酸半乳糖酯，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，在茶花中检出。[4,6-8]到目前为止，已从茶花中分离鉴定出12种黄酮醇。[7,8,9]近年来，在茶花中发现了一种新的黄酮醇糖苷-柴胡黄酮苷。[9]与茶叶相比，茶花含有较少的咖啡因，约占茶花干重的0.3%-1.1%。[4,9]咖啡因偶尔会有一些副作用，包括心悸、胃肠紊乱、焦虑、震颤、血压升高和失眠，这些都会导致DEM的增加，这就促进了不含咖啡因的茶的上升需求。[10,11]在过去的15年里，茶花吸引了越来越多的科学兴趣。国际茶花研究所和国际茶花研究开发中心分别在日本和中国建立。3、应用前景 茶花作为一种浪费而丰富的资源，在2013年被卫生部确认为一种新的食品来源。这表示茶花可能在不久的将来有广泛的应用。近年来，中日两国已开发出多种茶花保健/功能食品和饮料。一般来说，低品位茶叶是提取功能分子的首选来源.在未来，茶花可能成为提取功能分子的潜在资源。然而，制约茶花应用未来发展的因素仍然很多，高额的采摘费用，高制造成本，困难的采后快速处理，同时，要想利用茶花中的所有功能分子是不可能的。另外，合适的茶花提取物应评估在日常生活中消耗的金额，以便为人提供健康福利。参考文献[1] Bushman, J.L. Green tea and cancer in humans: A review of the literature. Nutr. Cancer 1998, 31, 151–159.[2] Trevisanato, S.I. Tea and health. Nutr. Rev. 2000, 58, 1–10.[3] Wan, X.C. Tea Biochemistry, 3rd ed.; China Agriculture Press: Beijing, China, 2003; pp. 8–67. (In Chinese)[4] Lin, Y.S.; Wu, S.S.; Lin, J.K. Determination of tea polyphenols and caffeine in tea flowers (Camellia sinensis) and their hydroxyl radical scavenging and nitric oxide suppressing effects. J. Agric. Food Chem. 2003, 51,975–978.[5] Cabrera, C.; Artacho, R.; Giménez, R. Beneficial effects of green tea—A review. J. Am. Coll. Nutr. 2006, 25,79–99.[6]Yang, Z.Y.; Xu, Y.; Jie, G.L.; He, P.M.; Tu, Y.Y. Study on the antioxidant activity of tea flowers (Camellia sinensis). Asia Pac. J. Clin. Nutr. 2007, 16, 148–152.[7] Yang, Z.Y.; Tu, Y.Y.; Baldermann, S.; Dong, F.; Xu, Y.; Watanabe, N. Isolation and identification ofcompounds from the ethanolic extract of flowers of the tea (Camellia sinensis) plant and their contribution to the antioxidant capacity. LWT Food Sci. Technol. 2009, 42, 1439–1443.[8] Morikawa, T.; Ninomiya, K.; Miyake, S.; Miki, Y.; Okamoto, M.; Yoshikawa, M.; Muraoka, O. Flavonol glycosides with lipid accumulation inhibitory activity and simultaneous quantitative analysis of 15 polyphenols and caffeine in the flower buds of Camellia sinensis from different regions by LCMS. Food Chem. 2013, 140, 353–360.[9] Yoshikawa, M.; Morikawa, T.; Yamamoto, K.; Kato, Y.; Nagatomo, A.; Matsuda, H. Floratheasaponins A–C, acylated oleanane-type triterpene oligoglycosides with anti-hyperlipidemic activities from flowers of the tea plant (Camellia sinensis). J. Nat. Prod. 2005, 68, 1360–1365.[10] Chou, T.M.; Benowitz, N.L. Caffeine and coffee: Effects on health and cardiovascular disease. Comp. Biochem.Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1994, 109, 173–189.[11] Nurminen, M.L.; Niittynen, L.; Korpela, R.; Vapaatalo, H. Coffee, caffeine and blood pressure: A critical review. Eur. J. Clin. Nutr. 1999, 53, 831–839.

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标（1）探究不同消化体系对TFPS的影响及TFPS的代谢机制。（2）明确TFPS在消化前后的抗氧化活性的变化及与消化酶的相互作用。2、研究内容以茶树花多糖（TFPS）为研究对象，研究：（1）体外模拟不同消化体系对TFPS的影响运用体外模拟口腔、胃、小肠以及粪便厌氧发酵研究TFPS在人体消化道中的消化过程；同时分析消化过程中TFPS各纯化组分的相对分子质量、单糖组成（游离单糖）、还原糖含量、及结构的变化，确定TFPS的消化及代谢情况。（2）TFPS在消化过程中自身活性的变化以及与消化酶的相互作用对于TFPS在模拟消化系统中的变化情况，我们研究其在消化前后的抗氧化活性变化和对α淀粉酶和α葡萄糖苷酶的作用。3、拟解决的关键问题

（1）TFPS在不同的消化体系（口腔、胃、小肠及大肠）中是否发生变化？其代谢机制是怎么样的？

（2）TFPS在消化前后自身活性有无变化？它在消化系统中与消化酶如何发生作用？

3. 研究的方法与方案

研究方法与实验手段:1、tfps模拟口腔消化参照ding等[1]报道的方法，并加以适当的修改称取12 mg nacl、15 mg kcl、100 mg 黏蛋白和200 mgα-淀粉酶溶于100 ml蒸馏水中，并调节溶液ph至7.0，得到模拟口腔液。称取适量tfps溶于水，配制成4 mg/ml的溶液。a管中加入5 ml tfps溶液和5 ml 模拟口腔液；b管中加入5 ml模拟口腔液和5 ml蒸馏水；c管中加入5 ml tfps溶液和 5ml 蒸馏水。将a、b、c管置于37℃的恒温水浴振荡器中反应（120 rpm），于0、5、15、30 min时取出1 ml反应液，并立即置于沸水浴中灭活10 min，重复3次。2、tfps模拟胃液消化参照hu等[2]的方法，并加以适当的修改。称取620 mg nacl、225 mg kcl、30 mg cacl2和120 mg nahco3溶于200 ml蒸馏水中，并用1 m的hcl调溶液ph至3.0，得到胃电解质溶液。之后称取25 mg胃脂肪酶、23.6 mg胃蛋白酶和1 ml ch3coona（1 m，ph 5.0）于100 ml胃电解质中，用磁力搅拌机混匀10 min，最后用1 m的hcl调ph至2.0，得到模拟胃液。称取适量tfps溶于水，配制成4 mg/ml的溶液。a管中加入10 ml tfps溶液和10 ml模拟胃液；b管中加入10 ml 模拟胃液和10 ml蒸馏水；c管中加入10 ml tfps溶液和10 ml蒸馏水。将a、b、c管置于37℃的恒温水浴振荡器中反应（120 rpm），于0、1、2、4 h时取出1 ml反应液，调ph至中性后置于沸水浴中灭酶活10 min，重复3次。3、tfps模拟小肠液消化参照hu等[2]的方法，并加以适当的修改。肠电解质的配制。称取540 mg nacl、65 mg kcl和24 mg cacl2溶于100 ml蒸馏水中，并用1 m的naoh调ph至7.0，得到胃电解质。将20 g肠电解质、20 g胰酶溶液（7%，w/w；4000 rpm，10 min）、40 g胆盐（4%，w/w）和2.6 mg胰蛋白酶混合均匀后调节ph至7.5，得到模拟小肠液。

将模拟胃液消化4 h后的样品溶液调ph至7.5，取10 ml处理后的样品溶液与3 ml模拟小肠液混合均匀得到a管；取模拟胃液消化中b、c管消化4 h后溶液10 ml，调ph至中性后分别加入3 ml小肠液得到新的b、c管。将a、b、c管置于37℃的恒温水浴振荡器中反应（120 rpm），于0、2、4、6 h时取出1 ml 反应液，并迅速置于沸水浴中灭酶活10min，重复3次。

4、 tfps的模拟大肠酵解参照chen等[3]的方法，并加以适当的修改。4.1 培养基的配制称取1 g蛋白胨、2.0 g酵母提取物、50 mg nacl、5 mg mgso4、20 mg kh2po4、20 mg k2hpo4、5 mg cacl2、1.0 g nahco3、100 mg氯化血红素、230 mg半胱氨酸-hcl、250 mg胆盐，1 ml吐温80、500 mg刃天青溶液、5 μl维生素k。混合均匀后调ph至7.0，得到基础培养基。分别称取1.2 g tfps、低聚果糖（fos）溶于120 ml含氮基础培养基，于120℃高压灭菌20 min。4.2 粪样悬浮液的制备与样品的发酵挑选4位身体健康的志愿者（两男两女，且近3个月未服用抗生素），收集新鲜粪便。各称取5 g粪便，用无菌的nacl溶液（0.85%，0.5 g/l半胱氨酸盐酸盐）稀释10倍，混合均匀后，300 rpm 离心5 min取上清，得到粪便悬浮液（尽量在超净工作台上进行）。吸取1 ml粪便悬浮液与9 ml灭菌后的tfps培养基、低聚果糖培养基、基础培养基于25 ml无菌锥形瓶中，用纱布和牛皮纸封口，置于厌氧发酵培养培养箱中，并放入两包厌氧产气袋，密封后置于37℃培养箱中厌氧发酵培养。分别在0、6、12、24 h时取样，用于下一步分析。重复3次。其中低聚果糖组（fos）作为阳性对照供试样液；未添加碳源的灭菌后含氮基础培养基作为空白对照供试样液（blk）。5、tfps在消化体系中的理化性质变化5.1相对分子质量（mw）的测定各时间点取样通过hplc-elsd进行测定。5.2单糖组成分析各时间点取样通过hplc-dad进行测定。5.3游离短链脂肪酸（scfa）测定各时间点取样通过gc进行测定。5.4其他化学性质分析各时间点取样还原糖含量通过dns法测定。各时间点取样总糖含量通过苯酚硫酸法测定。各时间点取样ph通过ph计测定。6、tfps在消化后与消化酶的作用6.1 tfps消化组分的α-淀粉酶抑制活性对α-淀粉酶(2u/ml)溶液进行预处理，将α-淀粉酶(2u/ml)溶液与0.2ml多糖溶液在37℃下预混合10 min。然后，以0.3 ml的5%淀粉溶液为底物，孵育15 min。加入2 ml dns试剂，结束实验，在100°c下加热15 min，冷却后在波长540 nm测得吸光度。以阿卡波糖为阳性对照物。α-淀粉酶抑制活性计算如下：

4. 研究创新点

本项目研究的特色在于利用我国丰富的茶树花为原料，研究其主要活性成分茶树花多糖经过消化系统的消化特性及消化前后抗氧化性质的变化以及与消化酶发生相互作用的情况。本项目的主要创新之处：

（1）系统研究茶树花多糖在消化系统中的变化过程。

（2）明确茶树花多糖在消化前后抗氧化性质的变化以及与消化酶发生相互作用的情况。

5. 研究计划与进展

实验时间：2018.12.20-2019.3.30计划：2018.12.20-2019.1.18，样品预处理及制备，各项指标的测定 2019.1.18-2019.2.28，体外模拟消化

2019.2.28-2019.3.30，茶树花多糖在消化前后抗氧化性质的变化以及与消化酶发生相互作用的情况