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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、研究意义

菊花（chrysanthemummorifolium）作为我国十大传统名花，也是世界著名的切花品种之一，具有很高的观赏价值和经济价值，在市场上占据极为重要的地位。但由于多数菊花品种是典型的短日照植物，自然花期主要在秋季，其开花时间及盛花持续期已渐渐不能满足人们的需求，同时作为生产和观赏的重要性状也会直接影响其上市时间和价格，限制了菊花产业发展。因此，研究菊花的成花机理和花期调控对实现菊花的周年化供应意义重大。

为适应国内外市场的需求，提高菊花生产水平，可以通过花期调控来延长或改变菊花花期。目前菊花的花期调控的主要方式是通过人工调控光照、温度、激素等手段来延迟或提前花期(郭仁德，2011)，耗费大量的人力和物力。所以，随着基因工程育种技术的发展，为了实现低成本调控菊花花期，通过分子生物手段揭示菊花的开花机理，为菊花的周年生产提供理论依据，则是花期调控研究的新方向。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标

在从菊花‘神马’中克隆得到一个bbxs转录因子cmbbx28.1的基础上，构建菊花cmbbx28.1遗传转化表达载体pdest_35aa_srdx_bckh- cmbbx28.1，通过拟南芥的遗传转化及阳性苗鉴定，分析拟南芥部分开花调控基因的表达量，研究菊花bbxs家族基因在植物开花过程中所发挥的作用及分子机制。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法

1. 构建菊花CmBBX28.1遗传转化表达载体：构建植物表达载体时，使用Invitrogen公司的Gateway技术进行载体构建；

2. 超表达载体质粒转化农杆菌：通过热激、冻融法将质粒转入感受态细胞EHA105；

3. CmBBX28.1基因超表达转化拟南芥：农杆菌浸花法转化拟南芥；

4. 转基因阳性苗鉴定：通过PCR技术对转基因苗进行基因表达半定量分析检测。

二、技术路线

见附件

三、实验方案

1．拟南芥遗传转化

本研究中拟南芥的遗传转化采用农杆菌浸花法，选用的超表达载体为构建好的pDEST-35AA-SRDX-CmBBX28.1载体，通过热激、冻融将超表达载体质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105，转化成功的农杆菌菌液采用浸花法转化拟南芥。

2．拟南芥筛选培养及阳性苗鉴定

将农杆菌侵染拟南芥后得到的T₁代种子播种于1/2MS 20 mg/L Hyg 25 mg/L Amp筛选培养基上筛选阳性苗，同时设置野生型对照组。后期通过提取阳性植株的DNA进行鉴定，在DNA分子水平上进行PCR检测，利用的基因特异引物与载体引物DNA水平上的鉴定引物分别是CmBBX28.1-test-F/SRDX-R，确认是否有CmBBX28.1基因插入。将T₁阳性植株单株收种，每株为一个株系，并分株系播种于上述筛选培养基上进行T₂代筛选，同时对T₂不同株系种子的萌发率进行统计，选择萌发比例为3:1的株系进行单株收种，T₃代种植以期获得单拷贝的纯合株系。此外利用定量引物对T₃代植株进行半定量分析。

四、可行性分析

1. 理论基础：

本人在本科阶段学习成绩优秀，工作细致认真、吃苦耐劳，已阅读相关文献，认真分析前人的研究数据并充分理解实验原理，结合老师的指导帮助，对项目进行了一定的创新，整个研究过程技术线路合理，目标明确。

2. 实践基础：

本人在2017到2018一学年中参加了SRT项目并担任组长，通过一年的实践学习，已基本熟练掌握分子实验的原理及操作流程，提高了动手能力，实验指导教师蒋甲福教授已开展菊花种质资源评价研究多年，具有丰富的理论基础和实践经验。

3. 研究材料：

课题组建有“中国菊花种质资源保护中心”，实验材料丰富，现已从菊花‘神马’中克隆得到BBXs转录因子CmBBX28.1，为下一步实验奠定基础。

4. 研究方法：

目前实验室在转基因花卉的组织培养，已经建立起了相应的技术体系，为本次研究打下了坚实的基础。

5. 设备基础：

本人所在观赏园艺学科为南京农业大学重点建设学科，具有从事遗传育种、细胞及分子生物学研究等各种必要设备与实验条件。主要仪器设备有：高速冷冻离心机、PCR扩增仪、荧光实时定量PCR仪、电泳系统、凝胶成像系统、分子杂交炉、Olympus相差显微镜、Leica CP SP2激光共聚焦显微镜、超低温冰箱、核酸定量仪、SANYO制冰机、Tomy-100组织破碎仪、分光光度计、计算机及数据分析软件、人工气候箱、光照培养箱、恒温培养箱等，可保障本研究的顺利实施，因此，具备完成项目研究所需的试验条件。

4. 研究创新点

1.利用从菊花‘神马’中克隆的cmbbx28.1基因构建了遗传转化载体；

2.通过cmbbx28.1基因超表达载体遗传转化拟南芥，获得阳性转基因株系；

3.为菊花的分子育种提供了优异基因，为进一步探究其功能奠定了基础。

5. 研究计划与进展

一、研究计划

1. 2018年5月，与指导老师交流沟通，积极向相关老师和师长师姐请教，确定合理的研究课题和正确的研究思路，明确自身的缺陷和不足，确定实验中所需知识储备和相应材料；

2. 2018年5月到6月，与指导老师详细交流，确定具体的实施方案，着手查找各类资料文献，理解相关原理，进入实验室准备实验工具、制作相关实验材料，清理出可随即投入使用的设备器材，同时完成开题报告的撰写；