在线固相萃取与高效液相色谱联用同时测定儿童水杯中9种双酚类环境雌激素开题报告
2022-12-28 10:18:11
1. 研究目的与意义
研究内容：
旨在将在线固相萃取与高效液相色谱-荧光检测联用，实现9种双酚类环境雌激素的同时测定，并将其应用于监测儿童水杯中的双酚类环境雌激素。
研究意义：
2. 文献综述
固相萃取技术及其在双酚类物质检测中的应用进展
摘 要：双酚类物质是常见的环境雌激素之一，对人类、环境和生态的影响受到广泛关注。本文介绍了双酚类物质的毒性，详细讨论了固相萃取法在装置与填料方面的发展，并对固相萃取在检测双酚类物质的前处理方法中的应用进行了总结和展望，为使用固相萃取技术建立一个方便实用的监测双酚类物质的分析方法奠定基础。
关键词：双酚类物质；固相萃取；双酚A
双酚A（BPA）主要用于生产聚碳酸酯和环氧树脂，是生产塑料制品的重要化工原料，广泛存在于奶瓶、医用包材、饮料瓶、自来水管道等塑料制品中[1]。通过直接接触或食物链进入生物体，影响动物的行为与精神活动[2]、损伤DNA并诱导肿瘤[3]，影响生殖发育[4]。
因此，加拿大、丹麦、欧盟及美国相继颁布法律法规，限制或禁止双酚A的使用。欧盟法律规定，直接与食品接触的塑料包材中BPA的迁移限量不得超过0.6mg/kg[5]；加拿大卫生部将BPA的每日最高耐受量设定为25微克/千克体重[6]。
这些法令出台后，为了满足市场需求，一系列与BPA结构类似的双酚类物质（BPs）作为BPA的替代品广泛用于工业生产，例如四甲基双酚A（TMBPA），双酚B（BPB），双酚C（BPC），双酚P（BPP），双酚Z（BPZ），双酚HF（BPHF），双酚AF（BPAF）和双酚AP（BPAP）[7-9]。
近期研究表明，BPs同样具有潜在的生态毒性及雌激素样作用[10, 11]。其中，纳摩尔浓度的BPB和BPAF对G蛋白偶联雌激素受体的雌激素样作用与BPA相当[12]，TMBPA和BPA一样会干扰中心体和微管的形成[13]，BHPF会引起小鼠妊娠障碍[14]，长期暴露在BPAF中的斑马鱼荷尔蒙失调[15]，而Schmidt等人发现，BPZ和BPAF在肝脏P450酶系作用下会发生可逆性的生物转化[16]。尽管目前已有文献报道塑料水杯中BPA的含量很高[17, 18]，但对儿童水杯中的这些双酚类似物的研究尚且不足。
这些双酚类环境雌激素存在的浓度低、毒害大，受到世界范围的广泛关注，建立相关的样品前处理方法，提高分析检测的选择性、灵敏度和准确度显得十分重要。传统样品前处理方法集中在液液萃取（LLE）[19]，但液液萃取过程中，通常需要消耗大量有机溶剂，样品易乳化，步骤繁多耗时，提取效率低，不仅待测物损失较高，也较难以处理大体积样品，准确度、灵敏度、便捷性难以提高。而固相萃取法（solid phase extraction，SPE）[20]因填料丰富多样，可应用于多种不同基质；所需有机试剂少，对环境的污染小，同时减少了有机溶剂中的杂质对被测分析物的影响；操作简单、快速、易于实现自动化等诸多优势，逐渐广泛应用于生物、环境分析领域。因此本文详细介绍固相萃取法在装置与填料方面的发展，并对固相萃取在检测双酚类物质的前处理方法中的应用进行总结和展望，为使用固相萃取技术建立一个方便实用的监测双酚类物质的分析方法奠定基础。
1 固相萃取的基本原理与装置
自19世纪50年代中期Braus等人首次提出固相萃取（Solid Phase Extraction,SPE）技术以来[21]，已逐渐发展出固相萃取小柱、膜盘、96孔板等多种形式的固相萃取装置（如图1），不断减少试剂用量，越来越符合绿色化学的要求。目前这些技术均已成功应用于检测双酚类环境激素的前处理过程（如表1）。
SPE的基本原理为通过颗粒细小的固相吸附剂选择性地吸附溶液中的待测物，待测物被吸附后，用体积较小的溶剂洗脱，以达分离富集待测物的目的，最后用适当的方法测定待测物浓度。固相萃取过程本质上与柱色谱分离过程相同，但固相萃取柱填料的粒径（40-80μm）比高效液相色谱填料粒径（3-10μm）大，柱长较高效液相色谱短，所以固相萃取柱的柱效和柱压比色谱柱低得多。柱效低使得经固相萃取柱富集的待测物须由高效液相色谱进一步分离，柱压低为目前蓬勃发展的在线固相萃取技术创造了可能。
图1 固相萃取装置：A固相萃取小柱，B固相萃取膜盘，C固相萃取96孔板
表1 固相萃取技术在双酚类环境雌激素的前处理过程中的应用
样品 | 目标物 | 固定相 | 分析方法 | 定量限μg/L | 参考文献 |
环境水样 | 氯酚 | 多壁碳纳米管 | HPLC | 0.08-0.8 | 22 |
竹子 | 氯酚 | 苯乙烯-二乙烯苯共聚物 | HPLC | 0.04-0.08 | 23 |
水 | 氯酚 | 磁性纳米Fe3O4粒子 | HPLC | 0.11-0.15 | 24 |
废水 | BPA与壬基酚 | C18 | HPLC | 1.2-1.9 | 25 |
奶瓶 | BPA | 大孔吸附树脂GDX-502 | HPLC | 0.2 | 26 |
2 传统固相萃取法
虽然固相萃取装置有多样的外形，但实际操作过程如图2所示，一般分为四步（以SPE小柱为例）：第一步是活化吸附剂，即将装有吸附剂SPE小柱用溶剂A预处理，即除去吸附剂中存在的可能干扰目标物检测的干扰物；第二步是上载样品，将待测样品溶于适当溶剂中，慢速经过到固相萃取小柱，吸附目标物和部分杂质；第三步是淋洗除杂，用适当溶剂B淋洗固相萃取柱，洗去SPE小柱上吸附的杂质；第四步是洗脱目标物质，用适当溶剂C洗脱出SPE小柱上吸附的目标物质，收集洗脱液即得目标物的富集液。
图2 固相萃取流程示意图
在此过程中，固定相与洗脱液的选择决定了分离效果[27]。如表1所示，检测双酚类似物的过程中，常用的固定相有十八烷基修饰的硅胶装填的C18固相萃取柱[25]，改性苯乙烯二乙烯基苯共聚物装填的HLB固相萃取柱[23]、大孔吸附树脂GDX-502固相萃取柱[26]、表面积较大的多壁碳纳米管柱[22]、易于分离的磁性材料[24]等。
3 在线固相萃取法
虽然传统固相萃取技术有效减少了有机溶剂的消耗。但前处理过程仍繁琐耗时，且从塑料容器中迁移出的BPA造成的背景污染，使分析低浓度BPA过程中会产生较大偏差[28]。而在线固相萃取（online SPE）技术可很好地弥补上述不足。在online SPE过程中，先用萃取柱保留样品进行富集，再改变流动相极性将样品洗脱入分析柱分离分析，在这样的模式下，不仅能够实现全自动的样品前处理，减少待测样品损失的同时，减少人工的投入、人为误差的影响，重复性好；也减少与塑料制品的接触，背景污染更少，准确度更高。此外，可重复使用的在线固相萃取小柱的开发使得online SPE法的成本更低。如图3，已有文献报道将 online SPE用于全自动同时测定9种性激素，每个分析周期仅需40 min，检出限达0.1-2.5 ng/mL[29]。
图3 在线固相萃取与高效液相联用装置示意图[29]
a为富集过程，固相萃取柱与分析色谱柱并联，样品加载、萃取并冲洗
b为分析过程，固相萃取柱与分析色谱柱串联，样品洗脱、分离并经LC/MS分析
4 总结与展望
在建立固相萃取法的过程中需充分考虑待测物和试样基体的性质，选择合适的吸附剂、洗脱剂，优化洗脱剂的流速与用量，如此方可建立方便实用的监测双酚类物质的分析方法。
以磁性材料、分子印迹材料等新型材料作为固定相，使得固相萃取法更为便捷，甚至实现特异性吸附，因而SPE在双酚类环境雌激素的监测分析领域的应用前景将更为广阔。而在线固相萃取法的建立，将有助于实现高通量的筛选。
参考文献
[1]J.Glausiusz, Toxicology: Theplastics puzzle, Nature 508 (2014) 306-308.
[2]曾怀才，陈锋．环境雌激素与健康[J]．实用预防医学，2003，10(5):818-820.
[3]H.Sakazaki, H. Ueno, K. Nakamuro, Estrogens receptor α in mouse spleniclymphocytes: possible involvement in immunity. Toxicol Lett, 133 (2002)221-229.
[4]杜艳，代汉慧，伍飏，等．双酚Ａ毒理学特性及各国对其用于食品包装材料的评估意见[J]．食品科技，2007, 32(10): 1-3.
[5]Commission Directive 2004/19/EC of 1 March 2004 amendingDirective 2002/72/EC relating to plastic materials and articles intended tocome into contact with foodstuffs, Off. J. Eur. Communities 2004 L71 (2010)8-21.
[6]European Food Safety Authority (EFSA), Opinion of thescientific panel on food additives, flavourings, processing aids and materialsin contact with food (AFC) related to 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane, EFSA J.2006 428 (2010) 1-6.
[7]Health Canada, Survey of bisphenol A in canned drinkproducts, 2010. http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/securit/packag-emball/bpa/bpasurveyenquete-can-eng.php.
[8]Y.Deceuninck, E. Bichon, P. Marchand, C.Y. Boquien, A. Legrand, C. Boscher, J.P.Antignac, B. Le Bizec, Determination of bisphenol A and relatedsubstitutes/analogues in human breast milk using gas chromatography-tandem massspectrometry, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 2485-2497.
[9]L.Wang, D. Zhang, X. Xu, L. Zhang, Application of ionic liquidbased dispersiveliquid phase microextraction for highly sensitive simultaneous determination ofthree endocrine disrupting compounds in food packaging, Food Chem. 197 (2016)754-760.
[10] Y. Yang, J. Guan, J. Yin, B. Shao,H. Li, Urinary levels of bisphenol analogues in residents living near amanufacturing plant in south China, Chemosphere. 112 (2014) 481-486.
[11] A.K. Rosenmai, M. Dybdahl, M.Pedersen, B.M.A. van Vugt-Lussenburg, E.B. Wedebye, C. Taxvig, A.M. Vinggaard,Are structural analogues to bisphenol a safe alternatives? Toxicol. Sci. 139(2014) 35-47.
[12] L.D. Scherer, A. Maynard, D.C.Dolinoy, A. Fagerlin, B.J. Zikmund-Fisher, The psychology of regrettablesubstitutions: Examining consumer judgements of Bisphenol A and itsalternatives, Health, Risk and Society 16 (2014) 649-666.
[13] L.Y. Cao, X.M. Ren, C.H. Li, J.Zhang, W.P. Qin, Y. Yang, B. Wan, L.H. Guo, Bisphenol AF and Bisphenol B ExertHigher Estrogenic Effects than Bisphenol A via G Protein-Coupled EstrogenReceptor Pathway, Environ. Sci. Technol. 51 (2017) 11423-11430.
[14] S.M. Ho, R. Rao, S. To, E. Schoch,P. Tarapore, Bisphenol A and its analogues disrupt centrosome cycle andmicrotubule dynamics in prostate cancer, Endocr. Relat. Cancer. 24 (2017)83-96.
[15] Z.B.Zhang, Y. Hu, J.L. Guo, T. Yu, L.B. Sun, X. Xiao, D.S. Zhu, T. Nakanishi, Y.Hiromori, J.Y. Li, X.L. Fan, Y. Wan, S.Y. Cheng, J. Li, X. Guo, J.Y. Hu,Fluorene-9-bisphenol is anti-oestrogenic and may cause adverse pregnancyoutcomes in mice, Nat. commun. 8 (2017) 14585.
[16] J.C.Shi, Z.H. Jiao, S. Zheng, M. Li, J. Zhang, Y.X. Feng, J. Yin, B. Shao,Long-term effects of Bisphenol AF (BPAF) on hormonal balance and genes ofhypothalamus-pituitary-gonad axis and liver of zebrafish (Danio rerio), and theimpact on offspring, Chemosphere 128 (2015) 252-257.
[17] J.Schmidt, P. Kotnik, J. Trontelj, Z. Knez, L.P. Maic, Bioactivation ofbisphenol A and its analogs (BPF, BPAF, BPZ and DMBPA) in human liver microsomes,Toxicol. in Vitro 27 (2013) 1267-1276.
[18] C.Simoneau, L. Van den Eede, S. Valzacchi. Identification and quantification ofthe migration of chemicals from plastic baby bottles used as substitutes forpolycarbonate, Food Addit. Contam. 2012 1-12.
[19] M.L.Spagnuolo, F. Marini, L.A. Sarabia, M.C. Ortiz, Migration test of Bisphenol Afrom polycarbonate cups using excitationemission fluorescence data withparallel factor analysis, Talanta 167 (2017) 367-378.
[20] G. Russo, F. Barbato, L. Grumetto,Development and Validation of a LC-FD Method for the Simultaneous Determinationof Eight Bisphenols in Soft Drinks, Food. Anal. Methods 9 (2016) 1-9.
[21] H.Braus, F.M. Middleton, G. Walton, Orangic Chemical Compounds in Raw andFiltered Surface Waters, Anal. Chem. 23 (1951) 1160-1164.
[22] Y.Q.Cai, Y.E. Cai, S.F. Mou, et al. Multi-walled carbon nanotubes as a solid-phaseextraction adsorbent for the determination of chlorophenols in environmentalwater samples, J. Chromatogr. A 1081(2005) 245-247.
[23] N.Sharma, A Jain, V.K. Singh, et al. Solis-phase Extraction combined withheadspace single-drop microextraction of chlorophenols as their methyl ethersand analysis by high-performance liquid chromatography-diode array detection,Talanta 83(2011) 994-999.
[24] J.D.Li, X.L. Zhao, Y.L. Shi, et al. Mixed hemimicelles solid-phase extraction basedon cetyltrimethylammonium bromide-coated nano-magnets Fe3O4 for thedetermination of chlorophenols in environmental water samples coupled withliquid chromatography/spectrometry detection. J. Chromatogr. A 1080(2008)24-31.
[25] 王晓东，赵新华，张新波，等．固相萃取－高效液相色谱－荧光检测法同时测定水中的壬基酚和双酚Ａ[J].分析试验室，2006,25(9):27-29.
[26] 宣栋樑，陈静．固相萃取－高效液相色谱法测定婴儿奶瓶中溶出的双酚Ａ[J].现代预防医学, 2008,35(23): 4663-4665.
[27] A.Gentili, D. Perret, S. Marchese, R. Mastropasqua, R. Curini, A. Di Corcia,Analysis of free estrogens and their conjugates in sewage and river waters bysolid-phase extraction then liquid chromatography-electrospray-tandem massspectrometry, Chromatographia 56 (2002) 2532.
[28] Y.Watabe, T. Kondo, H. Imai, M. Morita, N. Tanaka, K. Hosoya, Reducing BisphenolA Contamination from Analytical Procedures To Determine Ultralow Levels inEnvironmental Samples Using Automated HPLC Microanalysis, Anal. Chem. 76 (2004)105-109.
[29] Simultaneousdetermination of five estrogens and four androgens in water samples by onlinesolid-phase extraction coupled with high-performance liquidchromatographytandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1281(2013) 918.
3. 设计方案和技术路线
技术路线：
研究方案：
1 实验研究
1.1 溶液配制
称定0.01000 g双酚，置于10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得双酚的对照品贮备液。用1 ml移液管分别取对照品储备液各0.05 ml至同一个50 ml容量瓶中，5%甲醇水定容，得1.0 μg/ml混合对照品贮备液。按2或2.5倍逐级稀释得系列工作溶液。
1.2 富集分析条件优化
样品经左泵在线富集，经右泵分离，装置示意图如图1，阀切换程序如表1，梯度洗脱流动相为水（A）和甲醇（B）。富集柱为Kromosil C18色谱柱（150mm 4.6 mm i.d，5 μm）；分析柱为Sepax GP-C18柱（250 mm 4.6 mm i.d，5 μm）；柱温保持在30 ℃；激发波长为306 nm，发射波长为228 nm。
图1 在线固相萃取与高效液相联用装置示意图，a为富集态，b为分析态
（参考文献：Journal ofChromatography A, 1281 (2013) 918）
表1 阀切换程序
Time | Valve left |
0 | 6-1 |
6 | 1-2 |
10 | 6-1 |
1.2.1分析条件优化
A．激发发射波长优化
根据3D荧光扫描数据，确定荧光检测器波长。
B．右泵分析流动相比例优化
以50 ng/mL工作溶液进样，根据不同流动相比例下物质的保留时间，调试合适的梯度洗脱程序，使相邻物质的分离度最优。
C．反冲时间优化
在最优的分离度条件下，更改阀切换时间，保持其他条件不改变，每个方法平行进样2针50ng/mL工作溶液，以峰面积为纵坐标，物质为横坐标，作柱形图比较。
1.2.2在线富集条件优化
A．左泵流动相比例与富集时间
更改左泵流动相比例与富集时间，分别设置不同方法，每个方法平行进样2针50ng/mL工作溶液，以各物质的峰面积为纵坐标，物质为横坐标，作柱形图比较。并计算记录各物质的分离度及其RSD。
B．检测波长与流通池温度
将流通池温度设置为45℃，平行2针50 ng/mL工作溶液，与标曲中的50 ng/mL工作溶液任意平行的两针峰面积数据作比较，以峰面积为纵坐标，物质为横坐标，作柱形图比较。
1.3方法学验证
本研究考察实验过程中建立的分析方法的专属性、线性范围、精密度、稳定性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）、耐用性以及CCα、CCβ。在进行标准曲线绘制前将纯甲醇与稀释溶剂（甲醇:水=5:95）各平行三针空白溶液，与之后的对照品峰进行比较看否会有干扰，考察方法的专属性。配制0.25 ng/mL-200 ng/ml系列对照品混标液，以各待测物的色谱峰面积为纵坐标，各待测物的浓度为横坐标绘制标准曲线。取低、中、高浓度点的工作溶液，各连续进样6针，测定仪器的日内及日间精密度。以对照品混标液中浓度点的工作溶液，每隔6小时进一针，直至方法学实验结束，分别测定4℃和25℃下保存的样品的稳定性。另外，实验过程中还测定了以3倍信噪比（S/N）对应的样品中双酚类浓度作为检测限（LOD），以10倍信噪比（S/N）对应的样品中双酚类浓度作为定量限（LOQ），获得各双酚类物质的检测限和定量限。
1.4儿童水杯中双酚类物质的含量测定
在市场上购买20~30个儿童水杯，用电热套将V mL纯净水预热至100℃，倒入水杯，盖上表面皿，置于100℃烘箱中恒温4h。拿出冷却至室温（避光）即用10 mL玻璃注射器取5 mL进样，根据随行标曲计算含量。
溶液总体积减少量不超过3% （密度换算即总质量减少量不超过3%），其余溶液转移至锥形瓶中4℃贮存备用。
2数据处理及分析
利用Origin9.0软件处理分析数据，评价所建方法的优缺点。
3成果形式
以PPT及论文形式汇报课题结果4. 工作计划
2022年01月- 02月：查阅文献，了解在线富集分析、双酚a的研究进展，设计可行的在线富集装置，筛选双酚类环境雌激素；
2022年03月- 04月：开发并优化在线富集分析的方法，以便能够在线富集检测尽可能多的双酚类环境雌激素；
5. 难点与创新点
1.采用在线富集与高效液相色谱-荧光检测联用技术，一方面简化实验步骤，较大地减少人工操作所带来的误差，重复性好，另一方面提高分析检测的灵敏度、准确度；
2.在线富集分析可引入大体积的未经处理的样品溶液，为其他如血浆、尿液等样品中痕量双酚类环境雌激素的富集纯化提供了简便快捷的处理方法，耗时短，成本低，工作效率高，有望实现自动化的高通量检测；
