1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

药物在体内的运输通常是由转运蛋白参与完成的，其中的p-糖蛋白（p-gp）是由mdr1基因编码，是血脑屏障的重要组成部分[1]，分子质量为170kd，由1280个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由2部分组成，每一部分约有6个疏水跨膜区和1个atp结合位点，通过atp供给能量，将亲脂性药物泵出细胞外[2]。p-糖蛋白运输多种结构不同的化合物，包括很多兽医常用药物，如伊维菌素、链霉素、乙酰丙嗪、布托啡诺、红霉素、长春新碱、苯巴比妥、地塞米松等[4]。p-糖蛋白在很多有分泌或排泄功能的组织表达，如肝、肾和小肠，它限制了药物从肠道吸收，并促进药物排泄进入胆汁和尿液。另外，p-糖蛋白在血脑屏障高度表达，它限制了药物进入中枢神经系统[3]。

2001年研究发现mdr1基因存在4个碱基缺失，在超过10种纯种犬和杂种犬上都有发现[4]，这个mdr1基因突变与在19世纪80年代初期在牧羊犬上发现的伊维菌素敏感表型密切相关[5]。mdr1基因突变的犬，血脑屏障中缺乏p-糖蛋白，无法及时将药物等泵出脑部而在脑部大量蓄积，会引起神经学异常症状，严重时引发死亡。在mdr1基因敲除的小鼠研究中，也发现了伊维菌素不易透过血脑屏障的情况[6]，其对伊维菌素比正常小鼠要敏感100多倍，伊维菌素在脑部的渗透能力比正常老鼠高90多倍[7]。有mdr1纯合突变的犬不表达功能完整的p-糖蛋白，除了伊维菌素以外，该犬对多种p-糖蛋白-运送药物的敏感性增加，如莫西克丁、米尔贝肟、乙酰丙嗪、布托诺菲、地高辛、长春新碱、洛哌丁胺[8]。mdr1基因的碱基缺失主要出现在柯利犬上，但也不排除其他的犬种也会出现。在2010年的一项研究中，对德国的6999只纯种犬和379只杂种犬做了基因碱基缺失的调查，发现柯利牧羊犬、长毛惠比特犬、喜乐蒂牧羊犬、微型澳大利亚牧羊犬、澳大利亚牧羊犬、白色瑞士牧羊犬、英国古代牧羊犬、边境牧羊犬等9种犬存在等位基因突变，古代长须牧羊犬、安纳托利亚牧羊犬、灵缇犬、比利时坦比连犬、澳大利亚护羊犬、波尔瑞、澳大利亚牧牛犬、爱尔兰猎狼犬等8种犬上未发现mdr1基因突变[4]。且在不同的国家，柯利牧羊犬、澳大利亚牧羊犬、微型澳大利亚牧羊犬和英国古代牧羊犬的基因突变频率是相似的，而喜乐蒂牧羊犬的突变频率在日本、美国和英国是不同的，且亲缘关系接近的犬的mdr1基因突变情况表现类似[4]。但在有的文献中统计出在澳大利亚澳大利亚牧羊犬和喜乐蒂牧羊犬的mdr1基因突变频率基本上比在美国之前对该两种犬种统计的频率要高[9]。2005年在澳大利亚对33只柯利牧羊犬、17只澳大利亚牧羊犬、7只边境牧羊犬和7只喜乐蒂牧羊犬的mdr1基因检测中发现柯利牧羊犬、澳大利亚牧羊犬和喜乐蒂牧羊犬都出现基因突变的情况，pcr结果显示野生型mdr1基因的碱基序列为148bp，突变型mdr1基因的碱基序列为144bp，缺失了4bp的碱基，12%的柯利牧羊犬mdr1基因为野生型，64%的犬为杂合突变（携带者），24%的犬为纯合突变[10]。2003年美国的一项研究中发现柯利牧羊犬的mdr1基因比正常的比格犬mdr1基因缺失了atag4bp的碱基[11]。

在兽医临床治疗上，越来越多的犬表现出耐药性，甚至对一些药物产生严重的不良反应，这对兽医工作者和畜主来说在临床用药时需予以注意。目前对于南京地区的各类犬mdr1基因突变情况及发生频率的研究尚未有报道，我们尚不清楚该地区哪些品种的犬存在mdr1基因的碱基缺失从而对某些药物产生耐药性，若能对该地区的多种犬类做mdr1基因的检测并统计结果从而得出一定的结论，或在用药前或体检时对犬进行mdr1基因的检测，会对兽医工作者和畜主来说在临床用药时具有重要的指导意义。另外对于犬的繁殖来说有利于优化育种，检测并及时淘汰mdr1杂合突变和纯合突变犬，防止后代携带突变基因。本课题主要从基因角度研究犬多药耐药基因（mdr1）在南京地区多种犬类的突变情况，通过pcr的方法检测多种犬类的mdr1基因是否有基因碱基缺失及其类型和频率。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

检测南京地区犬mdr1基因碱基缺失的犬的品种和频率，找到其中的规律，从而对临床用药有一定的指导意义。

研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

该研究项目主要研究方法包括血样的采集、dna的提取、pcr扩增目的基因片段、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、pcr结果测序分析和样品检测结果统计分析。

技术路线

4. 研究创新点

该项目系统地对南京地区MDR1基因碱基缺失的情况进行调查，通过对大量的血液样本进行分析，找到不同品种犬的基因碱基缺失情况，从而对临床用药产生一定的指导作用。此项目的研究可以对兽医的临床用药有一定的指导，以防出现药物在体内的大量蓄积而产生的副作用，甚至导致动物的死亡。

5. 研究计划与进展

2016.10.1-2016.12.30：收集样本，提取犬血液中的DNA，PCR扩增目的基因片段，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，PCR结果测序分析，记录实验结果。

2017.1.1-2017.5.30：将实验结果进行统计与分析，对资料进行整体汇总，撰写毕业论文，进行毕业论文答辩，完成毕业设计。