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基质聚合物在生物膜形成和分散过程中的调控作用

David G. Davies

Department of Biological Sciences，Science III，Binghamton University，Binghamton，N.Y.13902，USA，E-mail：dgdavies@binghamton.edu，电话：607-77720061

1.在Pseudomonas aeruginosa中的藻酸盐生物合成 94

2．生物膜发育过程中藻酸盐生物合成基因的调控 101

3. 生物膜分散控制 105

4.藻酸盐生物合成和化学通信在生物膜中的活化 107

5．P. aeruginosa生物膜生命周期 112

参考文献 115

关键词：Pseudomonas aeruginosa，藻酸盐 ，生物合成，调控，自动生化器，

生物膜。

1.在Pseudomonas aeruginosa中的藻酸盐生物合成

生物膜是在自然和人造生态系统的水环境中开发和维持界面的一种生物性膜。 这些生物性膜由一种或多种由常驻微生物分泌的有机聚合物组成的凝胶状基质中的微生物组成。

已经显示生物膜细菌在天然（GEESEY ET AL.1977;COSTERTON ET AL.1994），工业（BOIVIN和COSTERTON 1991）和医学（KHOURY ET AL.1992）环境中的数量和代谢活性都占主导地位。在电子显微镜（GEESEY ET AL 1977; DEMPSEY 1981）和光学显微镜（ZOBELL 1943;ALLISON AND SUTHERL AND 1984）下可以观测到细菌生物膜中的细胞外聚合物对参与水生生物（JONES ET AL.1969，SUTHERL AND 1980）和海洋细菌（FLOODGATE 1972）的形成。认为细胞外聚合物的存在对于微生物生物膜的发育和持久性是必要的（WARDELL ET AL.1983; ALLISON AND SUTHERLAND 1987）。从淡水和海洋环境中分离的二氧化碳细菌的分析表明，它们生产的聚合物主要由酸性多糖组成（FLETCHER 1980; SUTHERL AND 1980; CHRISTENSEN和CHARAKLIS 1990）。

已经显示酸性多糖藻酸盐通过革兰氏阴性菌 Pseudomonas aeruginosa 在肺部感染过程中参与生物膜形成（DOGGETT 1969）。这种细胞外物质由 beta;-1,4-linked D-mannuronic acid 及其C-5差向异构体L-guluronic acid 构成（图1）。

P. eruginosa通常游离于环境中的生物膜、工业水系统和感染物之中。LINKER AND JONES (1966) 曾报导该生物体具有产生藻酸盐的能力。藻酸盐过量生产导致P. aeruginosa菌株产生大量的酸性多糖，并因此产生特殊的粘液样群落（mucoid colonies）。当应用于P. eruginosa时，术语mucoid限于在常见的琼脂培养基上孵育24小时时产生大的粘质群落的那些菌株，并且其表征来自以藻酸盐为主要组分的细菌糖萼的过量产生（GOVAN 1990）。P. eruginosa的粘液样变体是最常见的从伴随着基因遗传病囊性纤维化的呼吸道感染分离出来的菌株（DOGGETT ET AL.1977）。

囊性纤维化（CF），是欧洲血统的人群中最常见的致命性遗传性疾病。 它作为一种常染色体隐性遗传性状，每2000个新生儿中就有一个获得这种遗传。（MAY ET AL.1991）。本病的临床表现包括伴随持续性咳嗽的慢性肺疾病，高汗液电解质和导致营养吸收和反复腹泻(CHARTRAND AND MARKS 1983)问题的胰

腺异常。CF是由遗传缺陷引起的，会导致异常的电解质转运和来自外分泌腺和分泌性上皮的粘液分泌（MCPHERSON AND GOODCHILD 1988）。

在CF肺部感染的初始阶段，P. eruginosa分离株产生与藻酸盐生产无关的非粘液性集落。然而，随着时间的推移和抗生素治疗的开始，非粘液样形式开始过度产生藻酸盐（DOGGETT ET AL.1966）。 在CF-损伤的肺中开始出现粘液样形式并且占有生存优势，是从疾病晚期阶段患者的痰培养物中分离出来的主要病原体。

图一：藻酸盐的组成糖醛酸的结构

粘液表型的一个有趣的方面是当细胞在实验室培养中生长时其是不稳定的; 这样的细菌对非粘液表型具有异常高的逆转率（GOVAN 1975; GOVAN ET AL.1979 ）。这是因为非粘肿瘤的高自发突变频率，已经难以表征和映射藻酸盐生产过程中的结构基因突变。

LINKER AND JONES (1964)第一个发现是由Pseudomonas aeruginosa产生的藻酸盐。 后来发现这种藻酸盐类似于从海藻（LINKER AND JONES 1966; LINAND HASSID 1966A）中获得的具有商业价值的聚合物，以及后来用细菌Azotobacter vinelandii 的胶囊材料鉴定的多糖（GORIN AND SPENCER 1966）。

沿着PINDAR AND BUCKE (1975)在研究A. vinelandii的荚膜多糖过程中对于由藻类Fucus gardneri生产的胞外多糖的调查研究，LINAND HASSID（1966A，B）初步确定出了藻酸盐生物的合成途径。这项开创性的工作表明，第一藻酸盐前体是从Entner-Doudoroff途径和1,6-bisphosphate aldolase的碳水化合物中提取的果糖6-phosphate。类似的前体提取已经被表明发生在P. aeruginosa中 (MAY ET AL. 1991) 。

P. aeruginosa 的最初的藻酸盐生物合成酶报道来自（PIGGOTT ET AL 1981）。 这些研究者能够证明存在极低水平的phosphomannose isomerase（PMI），GDP- mannosepyrophosphorylase（GMP）和GDP- mannose dehydrogenase（GMD）。PADGETT AND PHIBBS（1986）检测到另一种藻酸盐生物合成酶phosphomannomutase（PMM）。

在继续研究藻酸盐生物合成的过程中，由芝加哥伊利诺伊大学的A.M . Chakrabarty博士领导的研究小组分离了来大量源于CF患者肺的稳定藻酸盐突变体（图2 ）。

图二：从囊性纤维化患者肺中分离得到的产出稳定的Pseudomonas aeruginosa 突变体菌株

原始分离物（8821）在富含营养的固体培养基上是粘液样的，并具有高逆转率。其中一个回复突变体被发现具有稳定的非粘蛋白表型，并被命名为菌株8822。将该菌株用methanesulfonate（EMS）诱变以产生稳定的粘液样衍生物：菌株8830。在EMS再次诱变后，产生第四菌株8852，其是非粘液型的，但可通过添加AlgR1（DNA结合蛋白）变回粘液型。

为了确定由这些过程产生的突变改变不是碳水化合物代谢基因损伤的结果，对每个突变体进行测试其在补充不同碳源的基本培养基上生长的能力。 在葡萄糖，葡萄糖酸盐，甘油，甘露醇，果糖，谷氨酸盐或丁二酸盐的存在下没有观察到生长畸变（DARZINS AND CHAKRABARTY 1984）。

其他有用的粘液菌株已经在许多实验室中制备。使用这些菌株及其衍生物，已经可以分离藻酸盐合成中有缺陷的单个结构基因突变体。这项工作（特别是在菌株8830存在的情况下）有助于开发我们目前对参与P. aeruginosa 藻酸盐生物

合成的基因的理解（BANERJEE ET AL.1983; DARZINS ET AL.1985A; ROYCHOUDHURY ET AL.1989; SA -CORREIA ETAL.1987）。这是由于藻酸盐基因的活性增加仅在粘液型菌株中发生。

P. aeruginosa藻酸盐生物合成途径的示意图如图3所示。 待分离和鉴定的第一种酶是来自algA的基因产物（DARZINS ET AL.1985B）。这是藻酸盐合成所需的第一种酶，并且已经发现是具有phosphomannose isomerase（PMI）活性以及GDP-mannose pyrophosphorylase（GMP）活性的双功能的酶（SACORREIA ET AL.1987）。 PMI负责果糖6-P和甘露糖6-P的相互转化。 甘露糖6-P通过phosphomannomutase（PMM）转化为甘露糖1-P。GDP-mannose pyrophosphorylase将甘露糖1-P转化为GDP-甘露糖，GDP-mannose dehydrogenase将GDP-甘露糖转化为GDP-甘露糖醛酸（GMD）。P. aeruginosa藻酸盐途径的其余步骤尚未完全阐明。在GMD的活化之后，将会发生乙酰化，聚合，差向异构化和输出。

图3：细菌藻酸盐生物在P. Aeruginosa中的合成途径。 编码每种酶的基因以斜体给出。

酶的缩写：PGI，phosphoglucose isomerase; PMI，phosphomannose isomerase;

PMM，phosphomannomutase; PGM，phosphoglucomutase;

GMP，GDP -mannose pyrophosphorylase;

GMD，GDP-mannose dehydrogenase。

藻酸盐生产中的剩余步骤包括聚合，差向异构化，乙酰化和输出。大量剩余的藻酸盐基因具有未知的功能。

乙酰化由algF进行（FRANKLIN AND OHMAN 1993; SHINABARGER ET AL. 1993）。该酶仅对甘露糖醛酸有活性，并且提出O-乙酰基通过保护来自差向异构酶的甘露糖醛酸基团来调节差向异构化的程度。甘露糖醛酸残基的乙酰化通过对抗藻酸盐裂解酶的裂解显示出一定保护性（GACESA 1992）。已经知道藻酸盐的乙酰化取决于algI和algI的产物，尽管这些基因产物的具体功能尚未完全阐明（FRANKLIN AND OHMAN 1996）。对D-mannuronic酸和L-guluronic酸进行差向异构化转化，这是algG基因产物进行的功能（FRANKLIN ET AL.1994）。将L-guluronic引入藻酸盐中可能导致成品聚合物的流变性质的变化，以及提供对抗藻酸盐裂解酶切割的保护作用（BOYD AND CHAKRABARTY 1994）。已经表明由P. Aeruginosa8830产生的藻酸盐由95％mannuronic酸和5％guluronic酸组成（ABRAHAMSON ET AL.1996）。没有显示任何guluronic酸残基排列成聚guluronic嵌段。在大约69％的mannuronic醛酸残基上发现O-乙酰化; guluronic醛酸残基不被乙酰化。

藻酸盐的聚合和输出被认为是由基因产物alg8，alg44，alg60，algE和algK进行的。尽管延伸反应的时间和空间方面尚未被充分描述，但是可以假定藻酸盐的聚合在乙酰化和输出之前发生。 目前认为Alg8，Alg44和Alg60（AlgX）是参与聚合过程的亚基（MAHARAJ ET AL.1993; REHM AND VALLA. 1997）。 algE基因产物是仅在P. aeruginosa的粘液样菌株中可以检测到的孔蛋白样蛋白质（REHM ET AL.1994）。 成熟形式的AlgE位于细菌外膜上，并被推定为参与聚甘露糖酸盐的易位。 虽然algK基因产物的表征不太好，但仍被认定为参与了藻酸盐的易位（AARONS ET AL.1997）。

已知P. Aeruginosa的藻酸盐的产生受转录激活因子以及因子识别序列的调节。藻盐基因的示意图如图4。已经显示DNA结合蛋白AlgR1是在三个分开的区域从mRNA起始位点与algD启动子区域相互作用的阳性转录激活因子（MOHR ET AL.1992）。 类似的结合位点已被假定用于algC启动子区（MAY ET AL.1991）。

图4：参与藻酸盐生物合成和调控的基因。

基因产物的功能如下：

AlgD，GDP-甘露糖脱氢酶;

Alg8和Alg44，参与藻酸盐聚合的可能膜蛋白;

AlgK的特征不明显，假定是参与运输;

AlgE，可能是参与运输的外膜孔蛋白;

AlgG，差向异构酶;

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