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焦化废水厌氧生物滤池中生物难降解物质的降解及微生物群落分布的对应分析

Yi Huang ^a,b, Xiaolin Hou ^b, Sitong Liu ^a,b,*, Jinren Ni ^a,b

^a北京大学环境工程系，水沙科学重点实验室，教育部，北京100871，中国

^b环境与能源学院、北京大学深圳研究生院，深圳518055，中国

摘要：焦化废水通常含有大量的生物难降解化合物，这就对生物处理焦化废水造成了很大的困难。本工作采用气相色谱-质谱联用仪测定厌氧滤池不同高度的有机化合物浓度，用16SrRNA高通量基因测序分析微生物群落分布。结果表明，该反应器共检出360个属，其中产气杆菌属、紫单胞菌、假单胞菌属、丛毛单胞菌属、沉积物菌属、肠杆菌属和产电菌属占微生物群落的主导地位。结果表明，它们与焦化废水中苯酚、甲基苯酚、二甲基苯酚、萘酚、三苯基、吲哚等难降解化合物的降解有着明显的相关性。特别是苯酚的降解与肠杆菌、假单胞菌和梭丁杆菌具有较高的降解系数。甲基苯酚的降解与肠杆菌和舒迪姆杆菌具有良好的相关性。除了著名的肠杆菌属、假单胞菌和产电菌可降解苯酚和甲酚，最重要的是，我们发现沉积物菌与苯酚、甲酚、二甲基苯酚、萘酚的降解的相关系数较高。这一新的发现将有助于酚、甲基苯酚、二甲基苯酚和萘酚降解菌的鉴定和相关细菌的生物强化分离。本研究有助于揭示焦化废水生物处理的“黑箱”模型，为研究功能菌降解生物难降解化合物提供了一条新的途径。

关键词：焦化废水；生物难降解化合物；细菌群落；高通量16SrRNA基因序列分析

1.前言

在中国，煤作为一个最普遍的燃料和化工原料被广泛应用于各种工厂^[1,2]。焦化、煤气净化、液化、炼制等工业过程中可产生焦化废水^{[ 3 ]}。硫氰酸盐、氰化物、多核芳烃(PAHs)和含氮杂环化合物等污染物是一类生物难降解有机物，被广泛认为具有致癌性和突变性。它们是焦化废水中的主要污染物^[1，3]。

在所有处理焦化废水中有毒有机物的方法中，生物处理被认为是有效的、经济合理的，而且对环境和健康的风险最小^[2]。厌氧缺氧系统、缺氧系统等生物处理工艺可实现对化学需氧量(COD)、氮、氰化物、硫氰酸盐、酚类、多环化合物和杂环化合物的高去除率^[4-7]。同时，生物处理阶段的稳定性受到化合物高毒性负荷的不利影响^[4]。因此，人们一致认为，具有高活性和较强生理活性的细菌菌株对生物处理过程的稳定性至关重要，因为它们能够有效地促进难降解有机物的去除，减轻废水毒性，从而提高废水的可生化性^[4，7-9]。

利用高效菌种处理含多种生物难降解有机物的焦化废水已成为众多研究的热点。例如，研究人员报告说，在厌氧缺氧系统中，尖叶伯克霍尔德菌可以提高焦化废水中喹啉的去除率^[1]；丛毛单胞菌属被发现能促进活性污泥反应器3-氯苯胺冲击负荷的抵抗^{[ 10 ]}。然而，以往的研究大多集中在一些高效细菌菌株对酚类^[6，11]、氰化物、硫氰酸^[12]、多环芳烃^[7]和氮杂环化合物^[13]等有机物的去除上。很少有研究研究有机物降解与微生物群落之间的进一步相关性，这一直被认为是一个“黑匣子”模型。这项研究建立了一套厌氧滤池-曝气生物滤池(AFBAF)系统.测定了不同处理阶段反应器的化学需氧量(COD)、生物需氧量(BOD₅)、氨氮(NH₄ -N)和pH值。此外，我们还从AF反应器的不同高度采集了水和污泥样品，并应用气相色谱-质谱(GC-MS)技术检测了不同高度的化合物浓度、高通量16SrRNA基因序列分析，对反应器不同高度的微生物群落进行了分析。在此基础上，建立了有机物降解与微生物群落分布的关系，指出了对某一污染物降解起主要作用的细菌种类。

2.材料和方法

2.1.原水

原水是从中国最著名的煤炭产区山西省的一家焦化厂收集而来的。对深棕色、恶臭的废水进行了无预处理处理。与其他报告的研究相比，铵、酚和油的含量都略高^[3，6]。进水中主要参数的浓度列于表1。磷添加量为0.05g KH₂PO₄/L作为微生物生长资源。在进水中加入浓硫酸，使pH值调节到7.5-8.5。

表1 AF-BAF系统进水特性

2.2.过滤电抗器

台架式AF-BAF系统(图1)由厌氧反应器(AF，工作体积4.5L)和好氧反应器(BAF，工作体积4.5L)组成。两个反应器都是用聚甲基丙烯酸甲酯制成的。第250天在AF反应器中分别在0 cm(反应器底部、进水口附近)、10 cm、20 cm、30 cm、40 cm和50 cm高度安装了6个端口，用于采集水样。在同一天(第250天)，在0-10cm、10-20cm、20-30cm、30-40cm和40-50cm的位置采集了5个污泥样本。在反应器中使用的载体是自制的专利功能性聚氨酯泡沫(FPUFS)。它们已成功地应用于其他有毒和难处理废水处理系统^[15，16]。在干燥条件下，尺寸为50 mm、50 mm、密度为1.0g/cm³、比表面积为3.5万m²/m³的载体在没有压缩的情况下小心放置在反应器中。

用水浴法将反应器温度保持在35plusmn;2℃，接近实际焦化废水处理设备的温度范围^[2]。在BAF反应器中，AF反应器的溶解氧(DO)保持在0.1mg/L以下，采用空气扩散器将DO维持在4-6mg/L左右。HRT在第一阶段保持在20h，在反应器运行的第二、第三和第四阶段保持在32h。相应地，反应器的体积流量在第一阶段为0.23L/h，在第二、第三和第四阶段为0.14L/h。整个反应堆运行持续250天。

2.3.接种微生物

在两个反应堆中加入从美国生物系统公司购买的一组微生物B350。B350已被证明对油田废水具有较高的处理效率^[15]。反应器运行期间不进行污泥排放。

2.4.化学分析方法

2.4.1污水参数检测

采用标准法测定COD、NH₄ -N、总氮(TN)、NO₃和V-酚类物质.采用Oxitop瓶呼吸法对BOD ₅进行了监测(德国WTW公司)。使用pH计(瑞士Mettler公司 )确定每个反应器的pH值，DO由DO仪检测(瑞士Mettler公司)。

图1 AF-BAF系统原理图

2.4.2气相色谱-质谱分析

分别在中性、碱性和酸性条件下(用10 mL亚甲基二氯化物从300 mL废水中提取3次)，用亚甲基二氯化物从废水中提取有机物。采用无水硫酸钠脱水，采用旋转蒸发器(上海亚东公司)将提取液浓缩至5mL。在此基础上，采用吹氮法干燥，溶解于1mL亚甲基二氯化物中.在测试前，样品用0.22lm有机相膜过滤，并存放在盖有密封膜的GC-MS瓶中。

本研究采用Agilent GC 6890N/MSN 5975为GC-MS装置。色谱柱为HP-35(30mtimes;250mu;mtimes;0.25mu;m) 以氦为载气，流速为1mL/min。喷油器温度和质量温度分别为280℃和150℃。烤箱的初始温度为70℃，然后以3℃/min的速度提高到280℃。电子源保持在70 eV。本研究提供了GC/MS程序中的扫描模式。

2.4.3有机物去除性能的鉴定

同时收集进水和流出物，然后进行了GC-MS分析的预处理(如2.4.2节所述).此外，在样品中加入2-甲基-1-硝基苯作为内标，确保GC-MS在正确的模型下运行，并验证了样品的响应性能与gc-MS的响应性能一致，并计算了这两种色谱图在同一保留时间的峰面积。进行比较，得到化合物的去除率。这样，可以避免潜在的对不同有机化合物的不同反应可能产生的影响，只要将相同化合物的峰值区域比较一下。

2.5.微生物多样性分析

2.5.1DNA提取和PCR扩增

采集不同高度AF的污泥样品(0.5g湿重)。DNA是根据PowerSOIL DNA分离试剂盒(Mobio实验室责任有限公司.)中描述的程序提取的。

用引物515F 5rsquo;GCMGCCGCGG)-3rsquo;和907R 5rsquo;-CCGCAATT CMTTGTT-3rsquo;在细菌16S核糖体基因V4-V5区进行PCR扩增(95℃2 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，72℃5 min)。其中条码是每个样本唯一的八碱基序列。在3份20mu;L的混合物中进行PCR反应，其中4mu;L为5times;FastPfu缓冲液，2mu;L为2.5mm dNTPs，每对引物为0.8mu;L(5mu;M)，FastPfu聚合酶0.4mu;L，模板DNA10ng。

2.5.2Illumina MiSeq测序

从2%琼脂糖凝胶中提取扩增产物并纯化。使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen生物科学，美国加州联合市)根据制造商的指示，使用QuantiFluorTM-St(Promega，美国)进行量化。纯化后的扩增产物按标准协议在IlluminaMiSeq平台上进行等摩尔和配对测序(2times;250)。

2.5.3测序数据的处理

原始fastq文件被分解复用，使用QIIME（版本1.17）进行质量验证，并使用以下标准：

1. 在一个10 bp滑动窗口中，在任何获得平均质量分数lt;20的地方，都截断250 bp的读取，丢弃小于50 bp的截断读取。
2. 确切的条形码匹配，引物匹配中的2个核苷酸不匹配，包含模糊字符的读取被去除。
3. 仅重叠长度超过10bp的序列，根据它们的重叠序列进行组装。丢弃不能组装的读数。

使用UPARSE（版本7.1 http://drive5.com/uparse/）将操作单位（OTU）聚类为97％的相似性截止值，并使用UCHIME识别和删除嵌合序列。 利用RDP分类器（http://rdp.cme.msu.edu/）对silva（SSU115）16S rRNA数据库分析每个16S rRNA基因序列的系统发育关系，确定阈值为70％。

2.6微生物群落与有机物降解的对应关系分析

在AF反应器的第250天，分别在0厘米（反应器底部，入口附近），10cm，20cm，30cm，40cm和50cm的高度安装六个端口用于收集水样。 样品被命名为W₀，W₁，W₂，W₃，W₄和W₅。 在GC-MS分析的通孔中，可以计算每两个取样口之间每种化合物（C₁，C₂ ... C_n）的去除百分比（方法已经显示）。 以自动对焦0-10cm高度期间化合物C₁降解为例，记录为C_1（0-1）。

同时，在同一天(250天)，分别在0~10 cm、10~20 cm、20~30 cm、30~40 cm和40~50 cm采集5个污泥样品，命名为S1、S2、S3、S4、S5。对每个样本随机选择3个载体。然后用16S高通量测序法对三种载体上吸附的细菌进行洗涤和混合，进行微生物成分分析。结果共发现10个门360属，命名为G₁、G₂...G_n。例如，S₁中的G₁被记录为G₁₁，通过16S高通量测序可以获得取样污泥中的比例。

得到这些数据后，用统计产品和服务解决方案(SPSS)计算化合物降解与细菌属之间的对应关系。以化合物C1的降解为例，分析了C_1(0-1)与G₁₁-G_1n、C_1(1-2)与G₂₁-G_2n、C_1(2-3)与G₃₁-G

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