1. 研究目的与意义（文献综述）

水体富营养化是全球普遍存在的严重环境问题。大量含氮、磷等营养物质的废水排入水体是引起水华和赤潮的主要原因。水体富营养化不仅破坏水体生态系统，造成人类生活饮用水的污染，也制约了工农业生产的发展。水体富营养化的问题引起各国的重视，各种废水脱氮除磷的工艺和指标也应运而生。在处理工艺这一方面，目前，大家耳熟能详的工艺有a²/o，sbr，氧化沟，新工艺有cbr等。在处理指标这一方面，我国污水厂出水标准由一级b提高到一级a，即出水含磷量不超过0.5mg/l；在美国和欧洲，要求将处理过的废水中的磷浓度降低到1~ 2ppm以下。

一般来说，磷的去除方法有三种，即物理法，化学法和生物法。物理法，如采用吸附法除磷，处理效果较好，但成本高，且不适用于大量废水处理。化学法，该方法除磷率较高，一般可达 75% ～85%，除磷效果也比较稳定，但化学污泥的产生容易造成二次污染，且化学试剂的购买会增加成本。而生物法除磷，此方法效率高，运行成本低，污泥产量小，对环境副作用也小，且生物除磷能产生高磷污泥，因此，在废水处理过程中回收磷，进行资源化处理，对于磷的可持续利用有重要意义。所以生物除磷技术被广泛采用。

生物除磷需要依靠具有除磷特性的微生物。这类细菌我们称之为聚磷菌（paos）。 其公认的除磷机理为在厌氧条件下即“压抑”状态下，聚磷菌将污水中大分子的有机物转化成如乙酸等低分子脂肪酸(vfa)，诱导激发菌体分解细胞内的多聚磷酸盐并产生atp，通过atp～adp的转换，将废水中的低链脂肪酸等有机物摄入细胞，以聚-β-羟基丁酸(phb)及糖原等有机颗粒的形式储存于细胞内，同时将聚磷酸盐分解成磷酸盐排出细胞外。在好氧环境下，聚磷菌将phb氧化分解并释放出能量，利用能量主动摄取污水中的磷，合成聚磷酸盐储存于细胞内。值得注意的是在聚磷菌的增殖过程中，好氧环境下所摄取的磷比厌氧环境下所释放的磷多得多，可达到细胞重量的6％～8％，甚至可达到10％，废水的生物除磷正是利用了聚磷菌的这一生理特点，将磷从污水中分离出来，形成高磷剩余污泥从系统中排走。

2. 研究的基本内容与方案

一、基本内容

（1） 分离并纯化污泥中除磷物生物，并进行摄磷实验来测试除磷效果，并从中挑选出除磷效果较好的细菌进行保藏。

（2）测定除磷菌的脱氮效果。

（3）采用固定化微生物技术，包埋除磷菌，并观测除磷效果。

（4）测定不同碳源条件下，除磷菌在厌氧末端与好氧末端，菌体内PHB的含量与释磷量

、吸磷量的变化。

（5）测量并分析除磷菌的16s rRNA数据。

二、目标

（1）获得除磷效果较好的除磷菌

（2）对这些除磷菌的生理生化性能进行测定

（3）进行16s rRNA序列测定并对数据进行分析

三、拟采用的技术方案及措施

1 实验材料

1.1主要仪器设备

摇床，超净工作台，高压灭菌锅，培养箱，电子天平，pH计，冰箱，紫外分光光度计、离心机、超声波细胞粉碎仪。

1.2培养基

（1）YG培养基:酵母浸膏1g,葡萄糖 1g，K₂HPO₄0.3g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蒸馏水1000ml。pH 7.0。（固体培养基加入20g琼脂）

（2）微量元素溶液：1000ml蒸馏水，1.5g FeCl₃·6H₂O，0.18g KI，0.06g Na₂MoO₄· H₂O，

0.15g H₃BO₃，0.03g CuSO₄·5H₂O，0.12g MnCl₂·4 H₂O，0.15g CoCl₂·6 H₂O，10g EDTA，0.12g ZnSO₄·7H₂O

（3）聚磷培养基：5g CH₃COONa，0.5g NH₄Cl，0.25g牛肉膏，0.5g胰蛋白胨，0.1g KH₂PO₄，2ml微量元素溶液，1000ml蒸馏水。pH 7.0。

（4）反硝化培养基：2g KNO₃，0.2g MgSO₄，0.5g磷酸氢钾，20g酒石酸钾钠，蒸馏水1000mL。pH约7.2。

（5）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，pH:7.4-7.6（6）醋酸钠培养基：5.5g CH₃COONa，1.0g NH₄Cl，0.1g KH₂PO₄，2ml微量元素溶液，1000ml蒸馏水。pH 7.0。

（7）葡萄糖培养基：4.02g葡萄糖，1.0g NH₄Cl，0.1g KH₂PO₄，2ml微量元素溶液，1000ml蒸馏水。pH 7.0。

2实验方法

2.1 菌株的分离、纯化与保存

（1）取10mL的颗粒污泥捣碎置于250mL锥形瓶中，加100mL蒸馏水，加入若干玻璃珠，于30℃摇床摇0.5h。

（2）吸取上清液0.5ml于盛有4.5mL无菌水的试管中，混匀，制成浓度梯度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的菌悬液。

（3）分别吸0.1mL于YG平板上，每个稀释倍数各做三个平板，涂布，于30℃培养箱培养2~3d。

（4）从18块平板中挑出形态不同的菌落（不排除同一菌株被重复挑到的可能），在YG固体培养基的平板上进行划线纯化，然后再转移到YG的斜面培养基上，于30℃培养箱培养3d。

（5）将斜面试管取出，于4℃冰箱保存。

2.2菌株的筛选

除磷能力测试：从保存培养基里挑出菌种，多次在YG平板上划线活化。挑取活化后的细菌于200ml 牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养两天。制备种子液。在250ml锥形瓶中加入100ml聚磷培养基。吸取种子液接种到培养基中，于30℃，150r/min摇床上震荡培养12h~14h，使得培养基内达到一定的菌量。然后停止震荡，静瓶培养1.5h~2h，细菌在这一阶段吸收小分子酸，释放磷。再次开启震荡培养4h~6h，细菌吸收磷。取菌液，在4000~6000r/min下离心15~20min，收集上清液，测量其中磷的含量，计算除磷率。

2.3种子液的制备

从富集培养基中吸取一定量的菌液在6000r/min下离心15min，弃上清液，取菌体，用无菌水水稀释菌体，以无菌水为参比，在600nm条件下，将菌液OD₆₀₀值调至1，即得到种子液。

2.4除磷菌特性的研究

（1）除磷菌脱氮效果的测定

将种子液接种到牛肉膏蛋白胨培养基里，富集培养后，将菌液接种到反硝化培养基中，同时制备不加菌液的空白培养基，以30℃，150r/min恒温振荡培养72h后，检测培养基中NO^3-和NO^2-的含量。

（2）固定化技术对除磷菌除磷效果的影响

选取除磷效果最好的细菌，富集培养后，制备种子液，包埋除磷菌，再将包埋后的除磷菌接种至100ml聚磷培养基中，同时制备不加菌液的空白培养基，于30℃，150r/min摇床上震荡培养，按除磷能力测试的方法观察菌的除磷效果。

（3）不同碳源条件下，厌氧末端与好氧末端菌体内PHB的含量与除磷效率的变化。

选取除磷效果最好的细菌，富集培养，制备种子液，并接种到100ml的醋酸钠培养基和葡萄糖培养基，同时准备不加菌液的空白培养基。采用上述除磷能力测试的方法培养菌液，测定菌体初始状态、厌氧末端和好氧末端的PHB含量与培养基内磷的含量，对比不同碳源条件下菌体合成PHB量的差别以及释磷量、吸磷量的差别。

2.5 16sr RNA序列测定

选取除磷效果最好的菌，测定16sr RNA序列并对数据进行分析，判断细菌的种属。

3一些测量方法

3.1磷的测量方法：钼锑抗分光光度法

分别取离心后的菌液上清 lmL 转移至 50ml 刻度试管中，稀释至50ml，准确加入1mL 抗坏血酸溶液，混匀，30s 后，加 2mL 钼酸盐混合液，混匀，即得磷样品显色液，室温静置 15min。在波长 700nm 处测定其吸光值，以未接菌的培养液为参比液调零，进行比色测定，从标准曲线上计算出相应值。

3.2氮的测量方法

（1）NO^3-的测量：紫外分光光度法

分别取离心后的菌液上清 lmL 转移至 50ml 刻度试管中，稀释至50ml，加1ml盐酸溶液，0.1ml氨基磺酸溶液，用光程长10mm石英比色皿，在220nm和275nm波长处，以去离子水加1ml盐酸溶液作为参比，测量吸光度。A_校=A₂₂₀-2A₂₇₅，从标准曲线上计算出相应值。

（2）NO^2-的测量：N-（1-萘基）-乙二胺光度法

分别取离心后的菌液上清 lmL 转移至 50ml 刻度试管中，稀释至50ml，加入1ml显色剂，密塞，混匀。静置20min后，在2h以内，于波长540nm，用光程10mm的比色皿，以水为参比，测量吸光度。从测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，获得校正吸光度，从标准曲线上计算出相应值。

3.3 PHB检测方法

（1）样品处理：取一定量的菌液，用去离子水离心（6000 r/min，5min）清洗3次后弃去上清液，稀释菌体至合适的浓度范围，进行超声波细胞粉碎（400~450W，30min，占空比1:1）；（注意降温）。取3mL处理后样品（三个平行样，下同）于消解瓶中，并加入3%酸化甲醇和氯仿各2mL立即密封，在100℃下（消解仪提前加热到100℃）消解4h（每15min轻摇），待消解后样品冷却至室温，剧烈振荡20min，之后离心（9000r/min，5min）分层[可以静止分层，放在冰箱24小时以上]。 用带钢针玻璃注射器取下层氯仿溶液经0.22μm有机滤膜过滤，取下层滤液进行色谱分析。

（2）色谱条件

柱型号：非极性柱，HP-5

载气：高纯氮气（N₂）；压力8.88psi；气体流速1.5mL/min；34cm/s

柱温：80℃保持1min，以10℃/min升至120℃并保持1min，以50℃/min升至270℃保持5min；

进样器温度：250℃；

检测器温度：FID 300℃，H₂ 50 mL/min；空气400 mL/min

（3）PHB浓度计算

无论是待测样还是标样，在检测条件一样的情况下，出峰面积比等于浓度（或含量）比，如果因浓度过高或过低而调整取样的量，计算时注意关注稀释倍数的变化。

3. 研究计划与安排

第1-2周：查阅相关文献资料，了解细菌分离的方法，确定实验方案，完成开题报告。参加毕业实习，并完成毕业实习报告。

第3-6周：查阅除磷微生物分离纯化的相关文献资料，并对数据进行采集。

第7-9周：查阅除磷微生物的各种性能等相关文献资料，对照实验室数据进行分析。

4. 参考文献（12篇以上）

[1]李博，赵敏，李宝赫，等．高效聚磷菌的筛选及除磷特性分析[j]．东北林业大学学报, 2009，37(10):85-87．

[2]连丽丽．聚磷菌的筛选及其对污水的除磷特性研究[d]．沈阳:辽宁师范大学，2009．

[3]刘亚男，于水利，薛罡，等．聚磷菌pao1-1的筛选及除磷特性[j]．中国给水排水，2005，21(10):13-17．